Électrophorèse

Question 1

Pourquoi est utilisée la dialyse?

Answer 1

Éliminer les sels présents dans un échantillon de protéine obtenu après précipitation (salting out)ou élution avec tampon riche en sels de chromatographie avec échange d’ions

Question 2

Décris en gros la dialyse.

Answer 2

Solution de protéines et de sels mise à l’intérieur d’un sac de dialyse mit dans un large volume de tampon. Diffusions des sels de l’intérieur vers la solution remet les solutions à l’équilibre.

Question 3

Qu’est ce qu’un échangeur d’anions?

Answer 3

Porte des charges positives qui sont capable de lier de manière réversible des anions.

Question 4

Qu’est ce qu’un échangeur de cations?

Answer 4

Porte des groupes chargés négativement qui lieront des cations de manière réversible.

Question 5

Décris la relation entre les protéines et les échangeurs.

Answer 5

1. Les protéines portes des charges positives et négatives donc peuvent lier des échangeurs anions et de cations
2. L’affinité de la protéine avec l’échangeur est affectée par le pH de la solution vu que la charge nette des protéines varie selon le pH
3. L’affinité de la protéine avec l’échangeur est affectée par la nature et les concentrations des ions en solution vu qu’ils compétitionnent pour les sites de liaison des échangeurs

Question 6

Quels sont les méthodes pour détecter quantitativement et spécifiquement les protéines purifiées par chromatographie (5)?

Answer 6

-Absorption des protéines dans l’UV :
protéines absorbent la lumière à 280nm, cependant méthode non spécifique.

-Essai colorimétrique (Bradford)
Produit qui donne une couleur mauve à la solution, l’intensité de celle-ci est proportionnelle à la concentration de protéines, cependant méthode non spécifique.

-Essaie enzymatique
Purification d’une ENZYME.

-Détection de la portée ne sur le gel SDS-PAGE
Obtenir le degré de pureté de la protéine.

-Détection de la protéine avec un anticorps (ELISA ou immunoblot)
Très spécifique

Question 7

Qu’est ce que l’électrophorèse en général?

Answer 7

La migration d’un ion dans un champ électrique pour séparer les molécules

Question 8

Quelle est la relation entre les forces électrostatiques (Fé et Ff) et la migration d’un ion dans un champ électrique d’intensité E.

Answer 8

Pour que la molécule puisse migrer la F électrique=qE > F friction=vf
(v=vitesse de migration, f=coefficient de friction)

Question 9

Que démontre le coefficient de friction?Il dépend de quoi (3)?

Answer 9

La résistance exercée par la solution sur l’ion pendant sa migration.
Il dépend de la taille, la force de l’ion et la viscosité de la solution

Question 10

Qu’arrive-t-il aux forces électrostatiques sur les ions dans un champ électrique constant?

Answer 10

Elles s’équilibrent/constant; qE=vf

Question 11

Qu’est ce que la mobilité électrophorétique?

Answer 11

La vitesse à laquelle chaque ion se déplace sur le gel (mu)
mu=v/E=q/f

Question 12

Quand est ce que les protéines ont une mobilité électrophorique nulle?

Answer 12

Lorsqu’elles sont à leur point isoélectrique (q=0) et vF=qE

Question 13

Qu’est ce que l’électrophorèse en zones?

Answer 13

Technique où l’échantillon est contraint à se déplacer dans un phase solide (ex: papier filtre, cellulose, gel)

Question 14

Quels sont les avantages de l’électrophorèse en zones (3)?

Answer 14

1. Élimine largement l’agitation causée par la convection (facteur limitant)
2. Requiert pas beaucoup de matériel
3. Technique puissante et facile pour la séparation des macromolécules

Question 15

Quels sont les gels communs de l’électrophorèse (2)? Quelle est leur caractéristique utile?

Answer 15

Agarose et polyacrylamide
Ils possèdent des pores de la taille des protéines à séparer

Question 16

Comment fonctionne l’électrophorèse sur gel?

Answer 16

La mobilité électrophorique des molécules et le principe de filtration sur gel séparent les molécules. Celles qui sont plus grand sont retardées par le gel d’électrophorèse.

Question 17

What does PAGE stand for?

Answer 17

PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

Question 18

Quels sont les facteurs qui déterminent la taille des pores du gel?

Answer 18

1. La quantité totale d’acrylamide (%T); où T= concentration totale d’acrylamide et de monomère bisacrylamide
2. La quantité de cross-linker (%C); où C=concentration de bisacrylamide (+C est grand, +pore sont petits)

Question 19

Comment préparé l’électrophorèse sur un gel de polyacrylamide (4)?

Answer 19

1. Couler le mélange entre deux plaques de verres pour qu’il polymérise en gel
2. Déposer les échantillons dans les puits
3. Avoir le même tampon pour les protéines aient une charge négative
4. Courant onctions de 100 à 200 V parcourt le gel pour que les protéines migrent vers l’anode (+) selon le ratio charge/masse (plus le gel est long, plus les bandes et la résolution sont fines)

Question 20

Que permet de faire l’électrophorèse en pH discontinu?

Answer 20

Augmenter la résolution en restreignant les protéines dans des bandes plus minces

Question 21

Quelles modifications sont apportées sur le gel dans l’électrophorèse en pH continu comparé au gel polyacrylamide?

Answer 21

On utilise deux gels dans des tampons différents:
1. Gel de séparation (polyacrylamide)
2. Gel de concentration (stacking); surmonte le gel de séparation avec un plus haute porosité. pH~2 unités de moins

Question 22

Décris les tampons dans le réservoir de la cathode et l’anode

Answer 22

Cathode: Le tampon dans le réservoir supérieur contient un acide faible (glycine, pKa=9.78)
Anode: Le tampon dans le réservoir inférieur est le même que le gel de séparation

Question 23

Décris en détail le parcours des ions lorsque le courant est branché.

Answer 23

1. Les ions du tampon du réservoir supérieur migrent dans le gel de concentration
2. Ils rencontrent un pH inférieur à leur pKa (<9.8), donc la glycine devient neutre et immobile
3. Ça crée une déficience en transporteurs de charges et une haute résistance électrique (R) qui cause un courant électrique (I) constant en un champ électrique (E) (E=IR)
4. Les protéines migrent plus vite dans le gel de concentration à cause de E
5. Les anions atteignent le gel de séparation (pH>9.8), les ions du tampon retrouvent leurs charges.
6. Les protéines ralentissent vu qu’il n’y a plus de déficience d’ions
7. Elles sont donc comprimées en bandes minces et ordonnées selon leur mobilité ce qui minimise la diffusion dispersive des protéines

Question 24

Qu’est ce qui affecte les protéines lorsqu’elles rentrent dans le gel de séparation?

Answer 24

Leurs taille; les petites protéines migrent plus rapidement et vice-versa

Question 25

Qu’est ce que le SDS (nom + description du rôle)?

Answer 25

Le sodium dodecyl sulfate est un détergent puissant qui se lie aux protéines à un taux de 1 molécule par 2 résidus d’acide aminé pour lui donner une conformation étendue chargée négativement

Question 26

Quelle est la conséquence de la charge négative apportée par le SDS à la protéine?

Answer 26

Le rapport charge/masse est le même pour les protéines de même masse et la séparation électrophorétique dépend uniquement de la filtration par les pores du gel

Question 27

Quels sont les avantages du gel SDS-PAGE (2)?

Answer 27

1. Le SDS dissout les agrégats et les particules insolubles qui peuvent bloquer les pores du gel
2. La mobilité électrophorétique possède une relation directe avec le poids moléculaire (relation linéaire entre la mobilité électrohphorétique et log du poids moléculaire

Question 28

Quelles sont les approches pour visualiser les bandes des protéines (3)?

Answer 28

1. La coloration avec le bleu de Coomassie brillant
2. Coloration nitrate d’argent
3. Autoradiographie (si protéines marquées avec un isotope radioactif S^35 ou C^14

Question 29

Décris le fonctionnement de l’électrophorèse par pH discontinu (beaucoup plus simple)

Answer 29

Le champ électrique se déplace dans les tampons et fait que les protéines chargées négativement se déplace vers l’anode. Dans le gel de concentration, les pores sont larges et permettent au protéines de stack à l’entrée du gel de migration. Vu que la taille des pores diminue drastiquement dans le gel de migration, les protéines se séparent par ordre de taille. Les protéines plus petites font face à moins de résistance du coup elles vont plus loin, plus vite.