Électrophorèse Flashcards
Pourquoi est utilisée la dialyse?
Éliminer les sels présents dans un échantillon de protéine obtenu après précipitation (salting out)ou élution avec tampon riche en sels de chromatographie avec échange d’ions
Décris en gros la dialyse.
Solution de protéines et de sels mise à l’intérieur d’un sac de dialyse mit dans un large volume de tampon. Diffusions des sels de l’intérieur vers la solution remet les solutions à l’équilibre.
Qu’est ce qu’un échangeur d’anions?
Porte des charges positives qui sont capable de lier de manière réversible des anions.
Qu’est ce qu’un échangeur de cations?
Porte des groupes chargés négativement qui lieront des cations de manière réversible.
Décris la relation entre les protéines et les échangeurs.
- Les protéines portes des charges positives et négatives donc peuvent lier des échangeurs anions et de cations
- L’affinité de la protéine avec l’échangeur est affectée par le pH de la solution vu que la charge nette des protéines varie selon le pH
- L’affinité de la protéine avec l’échangeur est affectée par la nature et les concentrations des ions en solution vu qu’ils compétitionnent pour les sites de liaison des échangeurs
Quels sont les méthodes pour détecter quantitativement et spécifiquement les protéines purifiées par chromatographie (5)?
-Absorption des protéines dans l’UV :
protéines absorbent la lumière à 280nm, cependant méthode non spécifique.
-Essai colorimétrique (Bradford)
Produit qui donne une couleur mauve à la solution, l’intensité de celle-ci est proportionnelle à la concentration de protéines, cependant méthode non spécifique.
-Essaie enzymatique
Purification d’une ENZYME.
-Détection de la portée ne sur le gel SDS-PAGE
Obtenir le degré de pureté de la protéine.
-Détection de la protéine avec un anticorps (ELISA ou immunoblot)
Très spécifique
Qu’est ce que l’électrophorèse en général?
La migration d’un ion dans un champ électrique pour séparer les molécules
Quelle est la relation entre les forces électrostatiques (Fé et Ff) et la migration d’un ion dans un champ électrique d’intensité E.
Pour que la molécule puisse migrer la F électrique=qE > F friction=vf
(v=vitesse de migration, f=coefficient de friction)
Que démontre le coefficient de friction?Il dépend de quoi (3)?
La résistance exercée par la solution sur l’ion pendant sa migration.
Il dépend de la taille, la force de l’ion et la viscosité de la solution
Qu’arrive-t-il aux forces électrostatiques sur les ions dans un champ électrique constant?
Elles s’équilibrent/constant; qE=vf
Qu’est ce que la mobilité électrophorétique?
La vitesse à laquelle chaque ion se déplace sur le gel (mu)
mu=v/E=q/f
Quand est ce que les protéines ont une mobilité électrophorique nulle?
Lorsqu’elles sont à leur point isoélectrique (q=0) et vF=qE
Qu’est ce que l’électrophorèse en zones?
Technique où l’échantillon est contraint à se déplacer dans un phase solide (ex: papier filtre, cellulose, gel)
Quels sont les avantages de l’électrophorèse en zones (3)?
- Élimine largement l’agitation causée par la convection (facteur limitant)
- Requiert pas beaucoup de matériel
- Technique puissante et facile pour la séparation des macromolécules
Quels sont les gels communs de l’électrophorèse (2)? Quelle est leur caractéristique utile?
Agarose et polyacrylamide
Ils possèdent des pores de la taille des protéines à séparer
Comment fonctionne l’électrophorèse sur gel?
La mobilité électrophorique des molécules et le principe de filtration sur gel séparent les molécules. Celles qui sont plus grand sont retardées par le gel d’électrophorèse.
What does PAGE stand for?
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
Quels sont les facteurs qui déterminent la taille des pores du gel?
- La quantité totale d’acrylamide (%T); où T= concentration totale d’acrylamide et de monomère bisacrylamide
- La quantité de cross-linker (%C); où C=concentration de bisacrylamide (+C est grand, +pore sont petits)
Comment préparé l’électrophorèse sur un gel de polyacrylamide (4)?
- Couler le mélange entre deux plaques de verres pour qu’il polymérise en gel
- Déposer les échantillons dans les puits
- Avoir le même tampon pour les protéines aient une charge négative
- Courant onctions de 100 à 200 V parcourt le gel pour que les protéines migrent vers l’anode (+) selon le ratio charge/masse (plus le gel est long, plus les bandes et la résolution sont fines)
Que permet de faire l’électrophorèse en pH discontinu?
Augmenter la résolution en restreignant les protéines dans des bandes plus minces
Quelles modifications sont apportées sur le gel dans l’électrophorèse en pH continu comparé au gel polyacrylamide?
On utilise deux gels dans des tampons différents:
1. Gel de séparation (polyacrylamide)
2. Gel de concentration (stacking); surmonte le gel de séparation avec un plus haute porosité. pH~2 unités de moins
Décris les tampons dans le réservoir de la cathode et l’anode
Cathode: Le tampon dans le réservoir supérieur contient un acide faible (glycine, pKa=9.78)
Anode: Le tampon dans le réservoir inférieur est le même que le gel de séparation
Décris en détail le parcours des ions lorsque le courant est branché.
- Les ions du tampon du réservoir supérieur migrent dans le gel de concentration
- Ils rencontrent un pH inférieur à leur pKa (<9.8), donc la glycine devient neutre et immobile
- Ça crée une déficience en transporteurs de charges et une haute résistance électrique (R) qui cause un courant électrique (I) constant en un champ électrique (E) (E=IR)
- Les protéines migrent plus vite dans le gel de concentration à cause de E
- Les anions atteignent le gel de séparation (pH>9.8), les ions du tampon retrouvent leurs charges.
- Les protéines ralentissent vu qu’il n’y a plus de déficience d’ions
- Elles sont donc comprimées en bandes minces et ordonnées selon leur mobilité ce qui minimise la diffusion dispersive des protéines
Qu’est ce qui affecte les protéines lorsqu’elles rentrent dans le gel de séparation?
Leurs taille; les petites protéines migrent plus rapidement et vice-versa
