Ecologia Molecolare Flashcards
Cos’è e a cosa può essere utile la TRASCRITTASI INVERSA?
La TRASCRITTASI INVERSA è un enzima capace di costituire una molecola di ssDNA complementare ad una molecola di RNA di partenza. Questo enzima è presente in diversi virus. La TRASCRITTASI INVERSA può essere utilizzata per ricavare il DNA d’ origine di una sequenza di RNA. Ad esempio, abbiamo un frammento di RNA e vogliamo sapere da quale molecola di DNA deriva, usiamo una TRASCRITTASI INVERSA, cosicché vadi a costituire un segmento ssDNA della molecola di RNA. A questo punto sfruttiamo una DNA POLIMERASI (aggiungendo primer e nucleotidi alla soluzione) per allungare il ssDNA, ottenendo un dsDNA (quello da cui deriverà l’ RNA d’ interesse), denominato cDNA (DNA COMPLEMENTARE). In questo modo possiamo creare delle librerie trascrittomiche di cDNA.
Cos’è l’ ELETTROFORESI SU GEL?
L’ elettroforesi su gel è una tecnica che permette di distinguere le diverse macromolecole (come DNA o RNA) in base alle loro dimensioni.
Struttura: Ad un polo dello strumento vi è un CATODO (carico positivamente) mentre all’ altro vi è l’ ANODO (carico negativamente). Tra i poli vi è una vasca contenente gel (spesso di agarosio). Nella porzione di gel in vicinanza dell’ anodo vengono creati dei pozzetti in cui verranno inserite le macromolecole di, ad esempio DNA. Il macchinario genererà un campo elettromagnetico.
Funzionamento: il campo elettromagnetico spingerà le molecole di materiale genetico dall’ anodo verso il catodo (poiché il materiale genetico presenta delle cariche superficiali negative, date dai gruppi fosfato). La velocità di spostamento sarà determinata dalla massa della molecola, qualora sia più grande, farà più fatica a spostarsi lungo le maglie di agar del gel, perciò si muoverà più lentamente. Alla fine della corsa si osserveranno delle bande a diversa altezza, che indicheranno la dimensione (la massa) della macromolecola.
Visualizzazione: la visualizzazione delle bande si ha grazie all’ aggiunta di sostanze che si legano al materiale genetico. Fino a poco tempo fa veniva utilizzato l’ ETIDIO BROMURO, il quale eccitato con la luce blu o UV emette fluorescenza
Cosa sono gli ENZIMI DI RESTRIZIONE?
Sono degli enzimi che si sono riscontrati per la prima volta nei batteri. Essi li usano come forma di “sistema immunitario” nei confronti delle infezioni virali. Tali enzimi di restrizione, o endo/eso nucleasi di restrizione, riconoscono brevi sequenze nucleotidiche (5-12 pb) di una molecola di materiale genetico ed effettuano un taglio. Nelle endonucleasi di restrizione questo taglio è interno alla molecola, può essere tale da creare delle STICKY ENDS (dove vi è la protrusione di uno dei 2 filamenti di DNA) o BLUNT ENDS (dove non vi è la costituzione di estremità protrudenti).
Di enzimi di restrizione riconosciamo gli ISOSCHIZOMERI, cioè quelli che riconoscono la stessa sequenza di DNA e i NEOSCHIZOMERI, i quali riconoscono la stessa sequenza di DNA ma effettuano tagli differenti tra loro.
Come si effettua il CLONAGGIO del DNA?
Il CLONAGGIO del DNA è il processo con il quale è possibile creare copie di materiale genetico d’ interesse. Un metodo utile che veniva usato è quello di sfruttare delle COLONIE BATTERICHE.
CLONAGGIO: identifico un gene d’ interesse che voglio clonare. Prendo un vettore plasmidico (una molecola di DNA circolare, presente nei batteri, capace di autoreplicarsi). Uso enzimi di restrizione per effettuare un taglio sul plasmide, uso l’ enzima DNA LIGASI per permettere, assieme allo sfruttamento di ADATTATORI (molecole che facilitano il processo di ligazione), al gene da clonare di legarsi al plasmide. Ora si è costituito una molecola circolare di DNA ricombinante. A questo punto vado a inserire il plasmide in un batterio, il quale sarà posto in una piastra Petri, in un ambiente adatto alla crescita, maturazione e riproduzione assessuata per scissione binaria. Si sarà formata, dopo un tot di tempo, una colonia di batteri, i quali avranno replicato dentro di se i vettori plasmidici, contenenti il gene d’ interesse. A questo punto basta prelevare i plasmidi dai batteri. Abbiamo ottenuto tante copie dello stesso gene, le quali verranno recuperate tramite processi di purificazione del DNA.
Cos’è la PCR?
La polymerase chain reaction è una tecnica che permette di ottenere tante copie dello stessa molecola di DNA. Per ottenere ciò viene usato lo strumento noto come termociclatore.
Ingredienti utilizzati nella PCR: Acqua (come solvente), Buffer (un tampone usato per mantenere la soluzione ad un pH ideale per il funzionamento della DNA POLIMERASI, a diverse T), DNA STAMPO (anche detto tamplate, che è il DNA che si vuole riprodurre), PRIMER (sono piccole molecole di RNA di circa 5-7 Nt, che si legheranno al ssDNA, permettendo alla DNA POLIMERASI di iniziare il processo di replicazione del DNA, poiché ora vi è l’ estremità protrudenti 3’OH disponibile), NUCLEOTIDI (che sono i mattoncini per la sintesi di DNA), IONI Mg2+ (presente spesso nel buffer, fondamentale per il funzionamento della DNA POLIMERASI), DNA POLIMERASI (enzima usato per la replicazione del DNA, ad oggi vengono usate quelle TERMOSTABILI, cioè quelle che mantengono struttura e funzione anche ad alte T, come la TAQ POLIMERASI, isolata dal batterio Thermus aquaticus).
Processo: si divide in 3 fasi principali.
1)Denaturazione del dsDNA in 2 ssDNA, ciò viene fatto portando la T a 95°C.
2)ANNEALING dei primer ai ssDNA, diminuendo la T a 65 °C.
3)Estensione dei primer grazie all’ azione della DNA POLIMERASI, aumentando la T da 72 gradi in su.
Questi 3 passaggi compongono un ciclo del termociclatore, che per effettuare una analisi completa impiega in media 30 cicli, creando fino a 68 miliardi di copie della molecola di DNA.
La VISUALIZZAZIONE dei risultati della PCR si hanno tramite la colorazione dei campioni che vengono fatti correre sul gel di elettroforesi.
DESIGN DEI PRIMER: Per disegnare i primer adatti all’ ANNEALING bisogna conoscere la sequenza target. I primer vengono sempre disegnati in direzione 5–>3. Questi primer devono avere una T di melting tra loro simile. È meglio che i primer tra loro non siano complementari e che non contengano lunghe sequenze palindrome.
SCOPI DELLA PCR: Analisi forense, identificazione di cibi OGM, test di paternità, diagnosi e trattamento di malattie, conservazione della fauna selvatica.
Cos’è la RT-PCR?
La Real-time polymerase chain reaction, è una tecnologia che sfrutta lo stesso concetto della normale PCR, solo che in questo caso è possibile osservare direttamente, mentre il processo avviene, la costituzione di molecole copia del DNA, quantificandole.
Per quantificare in tempo reale le molecole di DNA prodotte a fine di ogni ciclo, del termociclatore, si sfruttano 2 metodi:
1)INTERCALANTI FLUORESCENTI: in cui fluorofori come l’ etidio bromuro, SyBr green e l’ Eva Green, vengono intercalati alle molecole di dsDNA. Quando si formano i neo-filamenti alla fine del ciclo, essi vengono quantificati in base alla fluorescenza emessa dagli intercalanti.
2)SONDE DI IBRIDAZIONE FLUORESCENTI: alla molecola di dsDNA si lega una sonda composta da un fluoroforo e un colorante smorzante (detto quancher). Questa sonda è posta tra 2 primer (il forward e il reverse). Se la sonda è legata al dsDNA, la luce emessa da una sorgente, viene assorbita dal fluoroforo, che poi la riemette, questa però sarà subito assorbita dal quencher, non sarà quindi visualizzabile. Quando la DNA POLIMERASI agisce sul ssDNA (a partire dal primer), prima o poi incontrerà la sonda, e con la sua attività esonucleasica, la staccherà, allontanando il fluoroforo dal quencher, permettendo così la costituzione di fluorescenza misurabile. La quantità di fluorescenza è direttamente proporzionale al tasso di degradazione della sonda e quindi all’ attività della DNA POLIMERASI.
L’ intensità della luce emessa resce esponenzialmente man mano il proseguire dei cicli. Il ciclo nel quale si ha un aumento esponenziale del target è detto TRESHOLD CYCLE (ciclo soglia). Ad un certo punto si raggiungerà un plateau, ciò è dovuto o perché si sono esauriti i nucleotidi nel cocktail o perché la quantità di nuovo DNA va ad inibire la sintesi di ulteriore DNA.
Cos’è la T di melting?
La T di melting è la temperatura alla quale il 50% delle molecole di DNA in una soluzione risultano essere denaturate. Il processo di denaturazione avviene quando, ad alte T, i legami a idrogeno, che si formano tra 2 basi azotate tra 2 nucleotidi di differenti filamenti dello stesso DNA, si rompono. Molecole di dsDNA con un maggiore numero, in percentuale, di C-G, rispetto ad A-T, avranno una T di melting maggiore, questo è dovuto al fatto che i legami a idrogeno delle coppie C-G sono 3, mentre quelle A-T sono 2, sarà necessaria, perciò, più energia per romperli.
È possibile calcolare la T di melting attraverso la formula: 4(G+C)+2(A+T).
A modificare la T di melting è anche il parametro della salinità della soluzione in cui il DNA è posto. Maggiore è la salinità (più sali disciolti sono presenti) maggiore sarà la T di melting, questo perché gli ioni di sali disciolti tendono a stabilizzare la struttura del DNA a doppia elica.
Cos’è l’ IBRIDAZIONE?
È il processo per il quale è possibile fare appaiate tra loro filamenti ssDNA o di ssDNA con RNA. Questa metodica è utile per individuare sequenza specifiche d’ interesse, attraverso la complementarietà dei filamenti ibridati, nello specifico è utile per identificare i geni all’ interno di una libreria genomica e per il loro clonaggio.
Utilizzo un ssDNA o un RNA sonda (conosco bene la sua sequenza). Vado a denaturare il DNA che voglio indagare per vedere se vi è una corrispondenza con la mia sonda (aumento la T, spesso a 80°C). Ora abbasso la T, così da permettere l’ ANNEALING tra la sonda e le molecole di DNA. Vedremo che vi saranno molecole che si legheranno meglio o peggio con la sonda, andando a formare degli ETERODUPLEX. Quelle che meglio si legano alla sonda avranno un GRADO DI STRINGENZA più elevato. Ora andrò a filtrare i vari ETERODUPLEX a seconda dei loro gradi di STRINGENZA, andando a effettuare cicli di legame dell’ ETERODUPLEX a delle matrici solide seguite da dei lavaggi che elimineranno via via le molecole con grado di STRINGENZA sempre più elevato. Alla fine rimarranno quelle con il più alto grado di STRINGENZA, che identificheranno la mia molecola di interesse.
Come si può ISOLARE il DNA?
Il processo di isolamento del DNA è utile per separare la macromolecola dal resto delle componenti organiche (purificazione del DNA).
In particolare è necessario prima di tutto lisare le cellule, così da liberare il contenuto citosolico in soluzione, quindi è necessario rompere le membrane cellulari (o se presenti la parete cellulari). Ora bisogna eliminare tutte quelle tipologie di proteine e altre molecole organiche che intralcerebbero il processo di purificazione del DNA, inoltre vengono eliminate le DNAsi endogene (appartenenti alla stessa cellula, ma che, quando rotta la cellula, e messe in potenziale contatto con il DNA, potrebbero attaccare il DNA stesso), ed infine evitare la frammentazione del DNA.
La rottura di pareti e membrane cellulari può avvenire meccanicamente o attraverso detergenti. La degradazione di proteine, lipidi, nucleasi endogene avviene grazie a vari detergenti. La separazione fisica del DNA da proteine e altre molecole avviene grazie a RNAsi, proteasi, matrici selettive e precipitazione in alcool.
AGENTI DENATURANTI usati: 1)detergenti ionici (come SDS) che distruggono legami a H e interazioni idrofobiche. 2)agenti caotropici (come l’ urea) che denaturano le proteine rompendo i legami a H. 3)agenti riducenti, che rompono i legami disolfuro. 4)sali (per cambiare il livello di solubilità delle proteine). 5)calore. 6)proteasi.
3 METODI PRINCIPALI PER LA PURIFICAZIONE DEL DNA:
A)ESTRAZIONI ORGANICHE: in tal caso si usa un solvente organico (cosicché, essendo il DNA polare, grazie alle cariche negative superficiali, non si solubilizzerà) aggiungendo fenolo:cloroformio (per denaturare proteine e aumentare la densità della fase organica). Ora si creano 2 fasi, quella più superficiale acquosa (contenente il DNA) e quella più in profondità, detta organica, contenente proteine, lipidi e altre molecole organiche. Ora estraggo la componente acquosa con il DNA, ci aggiungo sali (così che Na+ si leghi alle cariche - del DNA, rendendola più stabile) e alcool (etanolo o isopropanolo) che vanno a creare una schermatura alla macromolecola. Si forma il precipitato che raccolgo post-centrifugazione e che in fine riporrò in un minimo volume con una soluzione tampone.
B) SALTING OUT: basso pH in soluzione acida, così da far precipitare le proteine e mantenere in soluzione il DNA. Estraggo la fase acquosa col DNA, aggiungo etanolo per farlo precipitare e lo estraggo. Questo sistema permette di isolare grandi quantità di DNA.
C)LEGAME SU SUPPORTO SOLIDO: uso supporti di resina a scambio ionico o silicio. In presenza di agenti caotropici il DNA si lega a tali matrici. Successivamente, lavando con vari reagenti recupero il DNA isolato.
Come funziona il SEQUENZIAMENTO SANGER?
Questa tecnica era usata per sequenziare molecole di DNA (cioè conoscere l’ ordine dei nucleotidi di una sequenza di DNA). Il funzionamento si basa sull’ utilizzo dei ddNTP (DIDEOSSINUCLEOTIDI trifosfati) che non presentano il gruppo OH al C3, di conseguenza non possono formare legami fosfodiesterici, per questo, quando vengono incorporati dalla DNA POLIMERASI, l’ attività di quest’ultima viene interrotta.
PROCESSO: Si creano 4 soluzioni, in ognuna metto il DNA da sequenziare e dei primers, assieme alla DNA POLIMERASI. Nelle 4 diverse soluzioni metto dNTP diversi (in uno metto dATP, in un altra dGTP, ecc). Facendo lavorare le DNA POLIMERASI, si formeranno dei frammenti di DNA di diverse dimensioni (questo perché la DNA POLIMERASI si blocca in maniera casuale, quando va a incorporare un dNTP). I frammenti vengono fatti correre su gel elettroforesi, e si ricostruisce la sequenza del segmento di DNA osservando in che punto quei dNTP non sono stati incorporati.
È possibile mettere tutti e 4 i tipi di dNTP in una stessa soluzione. In tal caso ai diversi dNTP intercalo un diverso fluoroforo, che, una volto esposto a radiazione luminosa, emette una fluorescenza diversa. La sequenza di DNA è ricostruita osservando la sequenza di picchi di assorbimento da parte dei fluorofori dei diversi dNTP.
Come funziona il TEST DI HAMES?
Il test di HAMES è usato per quantificare il livello di mutagenicità di una sostanza (cioè la capacità che la sostanza ha di produrre mutazioni nel DNA).
PROCESSO: Prelevo una colonia batterica di Salmonella Hys- (il che vuol dire che non può sopravvivere in un ambiente privo di HYS, poiché da solo non è in grado di produrla). La trasferisco in un a Petri, con un ambiente nutrito con estratto di fegato di topo, privo di Hys (detto S9). Al centro della Petri metto un filtro. Nel filtro faccio scorrere la sostanza di cui si vuole indagare la mutagenicità. Se, dopo un tot di tempo, si nota che delle colonie di batteri sono prosperate, allora vorrà dire che la capacità mutagenica della sostanza è alta, ha alterato il DNA di modo che ora le cellule batteriche producano da sole HYS, così da non essere più dipendenti dall’ ambiente circostante.
Come funziona il sequenziamento ILLUMINA?
Tale processo di sequenziamento avviene all’ interno di un vetrino con delle corsie (la flow cell).
PREPARAZIONE: il campione di DNA da sequenziare è frammentato casualmente, per tagmentazione o per sonicazione. Successivamente le estremità vengono riparate (overhangs rimosse o riempite) e ad esse si aggiunge un A. Ai frammenti ottenuti si aggiungono degli adattatori, che permetteranno l’ ancoraggio di essi ad un supporto solido (in tal caso tale supporto è formato da oligonucleotidi che rivestono la flow cell).
PROCESSO DI SEQUENZIAMENTO:
La DNA POL si sposta lungo il filamento di DNA creando il suo complementare. Il filamento stampo ora viene lavato via, rimane solo quello complementare ancora legato al supporto. All’ estremità del complementare vi è un adattatore, questo lega un secondo oligonucleotide del supporto (tramite il ripiegamento del ssDNA)a lui complementare. Ora, di nuovo, la DNA POL si lega al filamento reverse, permettendo la sintesi del forward (dsDNA). Ora, attraverso l’ aumento di T, si ha la denaturazione del dsDNA, i filamenti però, ora separati, rimangono attaccati al supporto. Questo processo è il bridge amplification e avviene contemporaneamente su migliaia di cluster del flow cell. Si sono formati molti cloni. COME SI SEQUENZIA –> a fine amplificazione, tutti i filamenti reverse sono lavati via. Un primer si attacca all’ adattatore del forward, la DNA POL aggiunge un dNTP marcato con fluorescenza con un terminatore (un fluoroforo) che blocca la sintesi. Ogni ciclo aggiunge un solo dNTP, e la macchina registra quale base è stata aggiunta (a seconda del diverso segnale di fluorescenza). Poi il fluoroforo è lavato via e si può introdurre la base successiva. Alla fine della prima read, la polimerasi estende il filamento, diviene doppio, viene denaturato e quindi linearizzato, il forward è lavato via, rimane il reverse. Inizia la read 2, si introduce il primer, si ha lo stesso processo di sequenziamento, e, alla fine il read product viene lavato via. Ciò è ripetuto per migliaia di reads che rappresentano tutti i frammenti.
Tale processo permette di sequenziare entrambe le estremità di un frammento di DNA (PAIR END sequencing). Con illumina si possono sequenziare solo sequenze corte (50-250pb). Ha un accuratezza del 99%. Le piattaforme illumina attuali sono: Miseq, Nextseq500, Hiseq2500, HiseqX.
Come posso isolare l’ RNA?
Isolare l’ RNA ci permette di comprendere l’ attività di espressione geniche di un organismo esposto ad un ambiente.
Il metodo di isolamento è simile a quello per il DNA.
Processo: rompo cellule e tessuti. Inattivo rapidamente RNasi e cerco di evitare contaminazioni. Denaturo complessi acido nucleico-proteina che si possono formare. Separo l’ RNA da DNA e proteine.
ESTRAZIONE ORGANICA DELL’ RNA: liso/omogeneizzo le cellule, aggiungo fenolo:cloroformio:Isoamilalcol e centrifugo. Separo la fase acquosa (con il RNA) da quella organica (con lipidi e proteine). Dopo l estrazione della fase acquosa, aggiungo etanolo, centrifugo, ottengo una fase acquosa da scartare, mentre RNA precipita sul fondo. Risoapendo il pellet di RNA usando una soluzione acquosa con tampone.
Voglio estrarre mRNA dall’ RNA TOTALE:
l’ mRNA è riconoscibile grazie alla coda di poli(A), uso allora un BINDING con una sonda oligo(dT) legate a sferette di resina, che si appaiano alle A. Ora separo l’ mRNA dalla matrice con acqua o tampone.
Analisi di RNA: con elettroforesi e per misurare la concentrazione sfrutto lo spettrofotometro.
Come funziona il PYROSEQUENCING?
È il primo metodo di sequenziamento di nuova generazione (post-Sanger). Il sistema si basa sull’ uso di pirofosfato inorganico, il prodotto di scarto della DNA POL, e substrato dell’ enzima SULFURILASI, il quale produce ATP, la quale sarà prelevata dall’ enzima LUCIFERASI per ossidare la luciferina e produrre un segnale luminoso.
Quando la polimerasi incorpora un nucleotide, rilascia energia, che alimenta la reazione che genera il segnale luminoso. La presenza del segnale ci conferma l’ appartenenza del nucleotide alla tal posizione della catena, mentre l’ intensità del segnale sarà proporzionale al numero di ripetizioni della base lungo lo stesso filamento.
Cos’è il sequenziamento ION TORRENT?
Tipo di sequenziamento basato sulla rilevazione di ioni idrogeno rilasciati durante la polimerizzazione del DNA.
Si prepara, prima di tutto una libreria di DNA, in cui i frammenti della sequenza di DNA da indagare vengono legati a degli adattatori. Poi il materiale genetico viene amplificato (attraverso l’ EMULSION PCR, in cui si formano delle gocce, ognuna contenente una macromolecola di DNA, in cui sono anche presenti i reagenti di amplificazione. Alla fine si otterranno cloni dei frammenti amplificati, immobilizzati in queste gocce).
SEQUENZIAMENTO: Viene usato un chip semiconduttore, con milioni di pozzetti (microwells). Le gocce con le copie di frammenti si depositano nei vari microwells. Successivamente il chip viene sommerso da un unico tipo di nucleotide, se esso è complementare allo stampo, viene incorporato, causando il rilascio di un H+, che modifica il pH della soluzione nel pozzetto. Sotto al pozzetto vi è una componente del chip sensibile alla variazione di pH, che converte questa ∆pH in corrente. Il cambiamento di voltaggio viene registrato e ciò indica l’ inserimento di quello specifico nucleotide nel filamento copia.
Cos’è il SINGLE MOLECULE REAL TIME SEQUENCING?
È un tipo di sequenziamento di terza generazione. Sviluppato dalla Pacifico Biosciences. Tale processo si basa sull’ imaging in continuo dell’ incorporazione di nucleotidi marcati, durante la sintesi di DNA.
METODO: Viene usato un film di metallo (100nm di spessore) in cui vi è un foro (ZMW,zero mode waveguide) di qualche decina di nn di diametro. Il film di metallo è depositato su di un substrato di diossido di silicone. Ogni ZMW diventa una camera di visualizzazione nanofotonica che fornisce un volume di rilevazione di 10^-21 L (zeptolitri), in cui l’ attività di una singola molecola può essere rilevata in un background di migliaia nucleotidi marcati in fluorescenza. Sulla ZMW si attacca una DNA POL, la quale progressivamente aggiunge al ssDNA copia i nucleotidi. Quando un nucleotide viene incorporato, esso perde il suo tag fluorescente, rilasciando un segnale che viene identificato dal rilevatore.
Tale sequenziamento consente di ottenere lunghe reads rapidamente.
Come funziona il SOUTHERN BLOT?
Il SOUTHERN BLOT è una tecnologia che permette di identificare, post elettroforesi, una sequenza di DNA d’ interesse, tra quelle che hanno corso sul gel.
PROCESSO: Dopo la corsa in elettroforesi su gel, il DNA va denaturato (trasferisco i frammenti di DNA in una soluzione di NaOH per 15 minuti). Ora i frammenti di DNA denaturato sono trasferiti su di una membrana (sono ancora nel gel) al di sotto di essa viene posto un filtro, rivestito da carta assorbente. Le estremità della carta sono immerse in un tampone che viene aspirato per capillarità. Successivamente il gel viene coperto con un foglio di nylon e sopra sono posti una serie di fogli di carta assorbente, in cima ai quali si pone una lastra di vetro ed un peso di circa 500 g.
Nell’ arco di 12-24h, per capillarità, la soluzione tampone tenderà ad attraversare il gel, il foglio di nylon e tenderà a risalire nei fogli assorbenti. I frammenti di DNA sono trascinati in verticale dal flusso del tampone e si depositano sulla membrana instaurando legami elettrostatici.
Si separa poi la membrana dal gel, e si immerge in una soluzione contenente una sonda marcata, che può ibridare con i segmenti complementari sul foglio, permettendo in questo modo di identificarli. Dopo il lavaggio della membrana, si rimuove la sonda non ibridata , si fa una lastra autoradiografica che mette in evidenza le bande in cui la sonda ha legato il DNA genomico.
Dall’ alto al basso: peso, carta assorbente, filtro, gel, membrana di carta da filtro con le estremità nella soluzione tampone.
Cos’è il NANOPORE SEQUENCING?
Metodo di sequenziamento basato sull’ alterazione della conduttanza elettrica, nel momento in cui uno specifico nucleotide passa attraverso un nanoporo (proteina con diametro tra gli 1.5 e 2 nm), incastonato in una membrana sintetica.
In particolare il nanoporo permette il passaggio di un solo nucleotide alla volta, a seconda del tipo di nucleotide (cioè portante una determinata base azotata) osserveremo una specifica modifica della conduttanza elettrica.
Il sistema può leggere entrambi gli strand uno dopo l’ altro.
Cos’è l’ eDNA? Come si campiona ed analizza?
L’ eDNA è il DNA AMBIENTALE. Questo DNA è raccolto per effettuare analisi della biodiversità di un luogo (si identificano specie a seguito della raccolta del loro DNA nell’ ambiente). Questo DNA non viene estratto da tessuti ma è presente nell’ ambiente, sottoforma di lisati cellulari, mitocondri, DNA liberato dalle cellule ecc… .
Per l’ identificazione tassonomica di usa il BARCODE (per raggiungere diversi livelli: specie, genere, famiglia ecc…).
Il campione da raccogliere può essere di un singolo individuo, o appartenente a più specie (bulk sample), oppure proveniente dall’ ambiente (Environmental sample) in questo caso si campiona acqua, terra, aria, ecc… .
Prendo un campione (es. 1L di acqua da un lago). A seconda della specie o taxa che voglio ricercare sfrutto dei marcatori genici diversi: spesso si usa la COI (citocromo ossidasi I), presente sul mtDNA. Quando il gene è marcato attuo un amplificazione con PCR (con un numero di cicli maggiore del normale, anche 40-60). Posso effettuare rtPCR (usando la sonda Taqman). A seguito si applica il processo di sequenziamento e sua validazione attraverso un database (BOLD o GenBank).
Questa tecnica di sfruttamento dell’ eDNA permette di:
1) identificare specie rare, criptiche ed elusive.
2) individuare migrazioni o deposizioni.
3) monitorare l’ abbondanza delle specie nel tempo.
4)determinare gli insiemi di specie.
5)valutare azioni di gestione (come il controllo di specie invasive e processi di restauro ambientale).
6) acquisire dei record (archivio di campioni congelati o essiccati da analizzare in futuro).
Come è stato individuato il PROTEO nelle acque sotterranee carsiche?
Il Proteo (Proteus anguis) è un anfibio che abita le grotte carsiche. Questo organismo è protetto sotto varie convenzioni, poiché minacciato dall' agricoltura intensiva, dalla produzione di energia idroelettrica e dall' urbanizzazione. Per la determinazione della presenza del Proteo in diverse zone si è sfruttata l' analisi dell' eDNA: 1)Sviluppo di primer specie specifici (CR, ovvero control regione, e 16S di rDNA). 2)Test della specificità dei primer. 3)Test dei limiti della rilevabilità del metodo (campione di 1/128 e 1/256 m^3 su 10 e 20L di acqua). 4)Test dell' utilità del metodo in natura: con SYBR chemistry o Taqman chemistry.
Cos’è la TRANSCRITTOMICA? Quali tipi di RNA sfrutta?
La TRANSCRITTOMICA è lo studio dell’ espressione genica.
Il sequenziamento dell’ RNA ci dà informazioni sull’ abbondanza e la sequenza delle molecole di RNA, si può anche studiare la variazione dell’ espressione di singoli geni (geni marcatori) a seguito di alterazioni ambientali che causano una variazione dell’ espressione di diverse proteine (e quindi di diversi RNA), [quest’ultimo processo si può fare solamente per organismi per cui si conosce il genoma (o la parte d’ interesse).
Il processo prevede:
1)estrazione dell’ RNA.
2)sua trasformazione in cDNA.
3)amplificazione con PCR.
QUALI RNA possono essere usati?
1)mRNA
2)RNA non codificante (come rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, miRNA, siRNA).
Tecnica dell’ RNA SEQUENCING.
1)isolo l’ RNA dal tessuto. Aggiungo inoltre delle DNAsi, così da eliminare il DNA di non interesse.
2)SELEZIONE dell’ RNA d’ interesse: RNA TOTALE, RNA impoverito di rRNA (che è il 90% dell’ RNA della cellula) che viene effettuato grazie al legame con delle sonde ssDNA, l’ ibrido risultante viene poi degradato da RNAsi; RNA CODIFICANTE (mRNA), tramite l’ aggiunta di poly-T i quali si legano al poly-A, il tutto poi si lega ad un substrato e gli RNA non codificanti vengono eliminati; RNA che si lega a specifiche sequenze.
3)Sintesi del cDNA, attraverso l’ uso della trascrittasi inversa. Ovviamente il RNA catturato viene prima frammentato, poi retrotrascritto, i frammenti risultanti di cDNA ora vengono uniti aggiungendo una adenina al 3’ e riparando il 5’. Alla fine si aggiungono degli adattatori.
4)Amplificazione del cDNA.
5)ANALISI delle sequenze.
Le informazioni che si possono ottenere da questo processo sono:
1)dati Qualitativi: identificazione di trascritti espressi, identificazione dei limiti di esoni ed interni, siti di inizio trascrizione e siti di poli-A.
2)dati Quantitativi: misura differenze nell’ espressione, splicing alternativo, poliadenilazioni alternative.
Il processo di sequenziamento prevede 2 tipologie:
1)SINGLE-END SEQUENCING con short reads (adatto per quando c’è un genoma o trascrittoma di riferimento).
2)PAIRED-END SEQUENCING con long reads (si usa per costruire un genoma di riferimento).
Non tutte le READS vanno bene, è necessario effettuare il TRIMMING (potatura) cioè la rimozione di dati con bassa qualità, attraverso la rimozione di adattatori e nucleotidi ambigui e lo scarto delle reads troppo corte.
Posso fare si che avvenga lo SPLICING ALTERNATIVO che permette la costituzione di trascritti differenti da quelli primari, cosicché siano codificanti per proteine diverse.
Nella TRASCRITTOMICA, come calcolo l’ espressione genica?
-Confronto geni di uno stesso campione: il numero di reads varia in proporzione alla espressione genica ma anche a seconda della lunghezza del trascritto.
-Confronto 2 campioni: il numero di reads varia al variare del livello di espressione ma anche a seconda della profondità di sequenziamento.
In ultima analisi, i dati di espressione genica variano a seconda di 3 fattori: lunghezza del gene, conteggio dei reads, la profondità del sequenziamento.
L’ RNA SEQ può fornire variazioni solo su quantità relative (questo perché viene assunto che ogni cellula ha in sé la stessa quantità di RNA, cosa che nella realtà è un falso), quindi per il sequenziamento si attuano processi di normalizzazione:
1)Quantile normalization (sviluppata per microarray).
2)Upper quartile (basata solo sulle read counts).
3)Normalization by totals (basata solo su read counts).
4)RPKM/FPKM (read/fragment per kilobase of transcript, per milion mapped reads).
5)TPM (Transcripts per milion): gli RPKM di tutti i trascritti in un campione sono sommati e normalizzati, in modo che i valori di espressione siano in totale 1M.
Calcolo dell’ espressione differenziale.
Le sequenze vengono annotate in base alle similarità BLAST, in base alla ricerca di domini proteici conservati, test ipergeometrici o analisi Gene Set Enrichment per trovare processi significativamente sovra o sotto-rappresentati.
