DNA-sekvensering Flashcards
Vad är DNA-sekvensering?
Vilka templet kan användas?
En metod som används för att fastställa ordningen på nukleotider.
- DNA
- RNA - via reverse transkription till cDNA.
- Protein - sekvensera cDNA och titta sedan på reading frames.
Vad är det man letar efter vid en sekvensering?
- Kända sjukdomsvarianter
- Kända behandlingsprediktiva varianter.
- Kända antibiotikaresistensgener
- Kända arter av mikroorganismer
Sekvenseringsresultat jämförs med referensgenom från databaser.
Hur stora är:
- SNPs
- Indel variationer
- Strukturella varianter
- kromosomalt avvikelser
- SNPs - 1 nukelotid
- Indel - 2-1000bp.
- Strukturella variationer - 1kb - 3mb.
- Kromosomavvikelse - >1000mbp.
- Viktigt att komma ihåg att alla avvikelser inte är förenliga med liv. Väldigt liten del av genometklarar av att ha en strukturell variation och ändå vara förenligt med liv.
- Alla avvikelser är inte sjukdomsalstrande.
- Alla sekvenseringsmetoder kan inte detektera alla avvikelser.
Vad är sanger sekvensering?
Vilka är metodens begränsningar?
- Den vanligaste och gold standard metoden för att hitta små avvikelser.
Begränsningar inkluderar:
- Avvikelser större än 200bp kan inte detekteras.
- Primers måste designas specifikt för varje område.
- Kan inte detektera varianter med en allelfrekvens under 15-20% då de inte kan urskiljas från bakgrundsbruset (mosaisism eller somatiska avvikelser) .
- Finns risk för allelic-dropout.
Vad är en allelic drop out?
En riskfaktor för felkälla vid sekvensering.
Om en heterozygot individ har en SNP på en alpel där primören ska binda in kommer inte genen av intresse, där en avvikelse kan finnas, amplifieras och resultatet kan bli falskt negativt.
Hur går en Sanger sekvensering till?
- Önskad del av DNA:t amplifieras med PCR-metod.
- Provet delas upp i två provrör - ett för forward reaktionen och en för reverse reaktionen - detta som en extra säkerhet om man skulle hitta en avvikelse då dessa två behållare ska ha komplementära varianter av samma avvikelse.
- Till varje behållare tillsätts vanliga nukleotider och dideoxynukleotider ( saknar -OH på 3’ änden) som är kopplade till fluorescerande prober.
- I provrören sker PCR-reaktioner där det slumpässigt inkorporeras nukleotider eller dideoxynukleotider, vilket leder till ett stopp i reaktionen.
- I behållarna fås olika långa fragment som sedan kan köras i en elektrofores - sekvensering.
De kortaste fragmenten, som statistiskt bör vara de där en dideoxynukleotid adderats som den första nukleotiden, kommer vandra längst i elektroforesen. Man vet därför att den kortaste sekvensen är den första basen i sekvensen.
Läs sedan från kortast till längst fragment.
Vad ska man tänka på vid en primer design till en sanger sekvensering?
- primerlängd: 18-24 baser.
- GC-innehåll bör vara 45-55%. Påverkar denatureringstemperatur.
- Får gärna ha GC i 3’ ändar för ökad stabilitet.
- Inga självkomplementära sekvenser längre än 4bp.
- Minst 50bp uppströms av genen av intresse.
- Designa inte en primer där en stor del av befolkningen har variation för att undvika allelic drop-out.
Vad kan resultatet av en Sanger påverkas av?
Resultatet kan påverkas av:
- För höga koncentrationer av templat dna och primers.
- Dålig design på primers som gör att de inte binder in ordentligt.
- Kontaminationer kan ge överlappning av peaks.
- Artefakter: för mycket färg eller luftbubblor.
Vad är en pyrosekvensering?
Sekvenseringsmetod som utnyttjar att det bildas PPi varje gång “rätt” nukleotid adderas till sekvensen. En bas adderas i taget och så ser man efter ljus.
Avvikelser som är väl kända och som man vet exakt vart de sitter kan automatiseras väl med pyro. Ex. Gilbert’s syndrom.
Vad är NGS?
Sekvenseringsmetod med mycket högre kapacitet än pyrosekvensering och sanger.
Många olika DNA-molekyler kan sekvensreas samtidigt. Med dessa metoder kan man exempelvis titta på helgenom, alla proteinkodande sekvenser, transkriptom, epigenetik, mikrobiologi ect.
Vad är CNVs?
Copy umber variation.
Antalet kopior av en viss gen varierar mellan individer. Man hr associerat vissa cancerformer till ökat antal CNVs.
Hur ser arbetsflödet ut för bioinformatiken efter en sekvensering?
- Demultiplexa - dela upp data utifrån patienter.
- Adaptertrimning - ta bort allt som hör till metoden och inte patientsekvensen. Ex. prober och adapter.
- Mappning - Använder referensgenomet.
- Filtrera bort artfakter.
- Ta bort varianter som inte är sjukdomsalstrande eller inte är intressanta.
- Tolkning.
Vad menas med täckning?
Vid stora delegationer är läsningarna av en NGS ofta för små för att täcka hela variationen. Man kan då istället kolla på “täckningen”
Dvs. hur många sekvensläsningar en individ har i förhållande till en referensgen vid en viss plats. Vid platsen för en stor deletiop får man en lägre täckning dvs. färre sekvensläsningar.
Vad finns det för olika NGS metoder?
- Illumina
- Ion Torrent
Hur går en illumina sekvensering till?
- Prep - addera adapter till ändar av DNA-sekvensen.
- Cluster generation - Fragment på yta är komplementär till adapter på DNA-sekvens.
- Bridge amplifiering.
- Sekvensering - ljussignaler i optisk färg som signal.
