Diversidade Clonal

Question 1

Qual a estrutura dos anticorpos?

Answer 1

O anticorpo é composto por 2 cadeias leves (sendo elas lambda e capa) e 2 cadeias pesadas. Além disso, essa molécula é dividida em domínios: Domínios variáveis (VL e VH) e domínios constantes (CL, CH1, CH2 e CH3).

Question 2

Qual a diferença entre o BCR e a imunoglobulina?

Answer 2

O BCR (B Cell Receptor) é uma proteína transmembrana dos linfócitos B que se liga diretamente a um antígeno, causando uma resposta intracelular e a produção de anticorpos.

As imunoglobulinas são moléculas secretadas pelos linfócitos B e possuem 2 funções: se ligar a antígenos específicos e estimular outras células do sistema imune para a destruição desse antígeno(função efetora)

A estrutura dos BCRs e das imuglobulinas são similares. Contudo a parte constante carboxiterminal dos BCRs possuem aminoácidos hidrofóbicos ao passo que nas imunoglobulinas são aminoácidos hidrofílicos. Isso faz com que os anticorpos possam ser secretados e os BCRs não.

Question 3

Qual a função da região constante das imunoglobulinas (extremidade carboxila terminal)?

Answer 3

A extremidade carboxiterminal da região constante dos anticorpos além de possuir uma ação efetora (recrutamento de outras células de defesa), também são responsáveis pelos 5 tipos existentes de anticorpos (IgA, IgG, IgD, IgE e IgM).

Question 4

Qual a diferença entre o BCR e o TCR?

Answer 4

O TCR está presente em linfócitos T. Eles são compostos, na maioria das vezes, por 1 cadeia alfa e 1 Beta (podendo ser também, 1 gama e 1 delta). Os TCRs alfa delta não conseguem se ligar diretamente ao antígeno. Ele necessita de uma molécula de MHC para que isso ocorra. Durante o reconhecimento do antígeno, o TCR reconhece o peptídeo e a molécula de MHC simultaneamente. O TCR possui apena 1 sítio de ligação ao antígeno (similar ao fragmento Fab do anticorpos) e ele nunca é secretado.

O BCR tem a mesma estrutura dos anticorpos e está presente nos linfócitos B. Diferentemente dos TCRs, ele consegue se ligar diretamente aos anticorpos. O BCR possui 2 sítios de ligação ao antígeno e pode ser secretado pelo linfócitos B.

Question 5

Como a molécula de anticorpo pode ser clivada?

Answer 5

A papaína cliva as ligações de dissulfetos na porção aminoterminal. Assim, originam-se 3 fragmentos: 2 fragmentos Fab (não possuem parte efetora) e 1 fragmento Fc (não possui parte variável).

A pepsina cliva as ligações de dissulfeto na porção carboxiterminal. Assim, origina-se um fragmento unido pela ponte dissulfeto, F(ab’)2. O restante da cadeia costante é clivado.

Question 6

Como é formado o sítio de ligação ao antígeno da região variável do anticorpo?

Answer 6

Na região do anticorpo, existem porções que variam mais, denominadas hipervariáveis (HV1, HV2 e HV3) e porções que variam menos, denominadas estruturais (FR1, FR2, FR3 e FR4). Dentre as regiões hipervariáveis, a que varia mais é a HV3.

Estruturalmente, as porções hipervariáveis são alças que saem da folha Beta pregueada (formada pelas regiões estruturais). Essas alças são denominadas de CDR1, CDR2 e CDR3. A região de ligação ao antígeno é formada pela junção de 6 CDRs, 3 da cadeia leve e 3 da cadeia pesada.

Question 7

O que é um epítopo (determinante antigênico)?

Answer 7

É a parte estrutural do antígeno que é reconhecida pelo anticorpo.

Question 8

Como são chamadas as moléculas de MHC de classe I e de classe II nos humanos?

Answer 8

MHC de classe I = HLA-A2

MHC de classe II = HLA-DR1

Question 9

Quais são as características do MHC de classe I (HLA-A2)?

Answer 9

• Formada por 1 cadeia alfa e uma cadeia de beta microglobulina;
• Apenas a cadeia alfa atravessa a membrana plasmática;
• Possui 4 domínios: alfa 1, alfa 2, alfa 3 e beta microglobulina;
• O sulco de ligação do peptídeo é formado pelas região alfa 1 e alfa 2;
• Está presente em células nucleadas (com diferente expressões entre elas).
• Ligam-se a peptídeos de 8 a 10 aminoácidos de comprimento em ambas as extremidades (aminoterminal e carboxiterminal).

Question 10

Quais são as características do MHC de class II (HLA - DR1)?

Answer 10

• Formada por 1 cadeia alfa (diferente da do MHC de classe I) e 1 cadeia beta;
• Ambas as cadeias alfa e beta atravessam a membrana plasmática;
• Possui 4 domínios: alfa 1, alfa 2, beta 1 e beta 2;
• O sulco de ligação do peptídeo é formado pelos domínios Alfa 1 e beta 1;
• Encontrados em células que fazem parte do sistema imune, como os macrófagos, linfócitos B, células dendríticas….
• Não têm restrição quando a tamanho dos peptídeos ligantes, uma vez que a ligação com a sulco do MHC de classe II se dá ao longo do esqueleto do peptídeo, e não em suas extremidades.

Question 11

O que são correceptores de linfócitos T e quais são eles?

Answer 11

Os correceptores são outros tipos de ligantes que estão presentes nos linfócitos T, que ajudam na estabilidade e sensibilidade da ligação com o antígeno. Eles podem ser o CD4 e o CD8. Esses correceptores se ligam em um sítio distante da sulco de ligação do peptídeo (CD4 ao domínio alfa 2 e beta 2, e CD8, ao domínio alfa 3), o que permite com que o MHC se ligue ao TCR e a eles simutaneamente. Logo os linfócitos T podem ser: Linfócitos T CD4 (auxiliadores) ou Linfócitos T CD8 (citotóxicos).

O CD4 se ligam a moléculas de MHC de classe II (HLA-DR1) e o CD8 se ligam a moléculas de MHC de classe I (HLA-A2).

Question 12

Quais são as características dos TCRs gama/delta?

Answer 12

• São especializados em determinados ligantes (proteínas de choque de calor, ligantes não peptídicos…)
• Não são restritos ao MHC de classe I e de classe II, podendo se ligar a antígenos livres ou através de moléculas semelhantes aos MHCs, mas não tão polimórficas.

Question 13

O que são fragmentos gênicos?

Answer 13

São fragmentos presentes dentro dos genes que codificam as regiões variáveis dos receptores. Esses fragmentos (V, D e J) podem ser rearranjados ao acaso por meio do rearranjo gênico para formar uma região V completa, processo conhecido como recombinação somática (presente apenas nos linfócitos).

A montagem de uma região V completa compreende a recombinação de 2 fragmentos gênicos (na cadeia leve da imunoglobulinas ou na cadeia alfa dos TCRs) ou 3 fragmentos gênicos (na cadeia pesada das imunoglobulinas ou na cadeia beta dos TCRs).

Question 14

Como é formado o RNAm de uma cadeia leve completa de imunoglobulina?

Answer 14

Primeiro forma-se o éxon da região V: o fragmento gênico V se liga ao fragmento J.

Logo em seguida, o éxon da região V se liga ao framento C (da região constante).

Por fim, o transcrito primário passa pelo processo de splicing, formando o RNAm da cadeia leve.

Question 15

Como é formado o RNAm de uma cadeia pesa completa de imunoglobulina?

Answer 15

O processo se dá exatamente igual ao de cadeia leve. Contudo a formação do éxon da região V ocorre em duas etapas: Primeiro o fragmento D se junta com o fragmento J e, logo em seguida, o fragmento V se junta com o fragmento DJ.

Question 16

O que é o peptídeo líder (L)?

Answer 16

O peptídeo líder é um segmento que precede o fragmento V. Ele é responsável por direcionar a proteína para a via secretora celular. A sequência líder é retirada após a tradução, e são formadas, então, as ligações de dissulfetos.

Question 17

O que é o RSS (Recombination Signal Sequence)?

Answer 17

O RSS é uma sequência sinal de recombinação formada por um heptâmero, seguida de uma região espaçadora (que pode ter 12pb ou 23pb), que, por fim, é seguida por um nonâmero. O RSS é responsável, juntos com enzimas recombinases, a regular a recombinação somática, seguindo a regra 12/23.

Question 18

Como a recombinação somática é regulada?

Answer 18

Ela é regulada pelo RSS e por enzimas recombinases (RAG 1, RAG 2, TdT, Artemis…). O RSS faz com que fragmentos cujo espaçador tenha 12pb recombinem-se apenas com fragmentos cujo espaçador tenha 23pb e vice-versa (regra 12/23).

Question 19

Por que o CDR3 é mais variável que o CDR1 e o CDR2?

Answer 19

Pois o o CDR1 e o CDR2 são codificados pelo próprio fragmento V. Já o CDR3, que ocupa o sítio de ligação ao antígeno, é codificado pelos recombinação do fragmento V e J (na cadeia leve ou na cadeia alfa) e V,D e J (na cadeia pesada ou na cadeia beta).

Question 20

Como acontece o recombinação somática quando a sequência codificadora de 2 segmentos gênicos encontra-se na mesma orientação transcricional do DNA?

Answer 20

Nesse caso, quando há o alinhamento das 2 regiões do RSS, há a formação de uma alça de DNA interviniente (que é eliminada na forma de um DNA circular), formando assim a junção sinalizadora. A estrutura que permaneceu no DNA é denominada de junção codificadora.

Question 21

Como acontece o recombinação somática quando a sequência codificadora de 2 segmentos gênicos encontra-se orientação transcricional invertida?

Answer 21

Nesse caso, o alinhamento das 2 regiões do RSS, faz o DNA interviniente tomar uma forma helicoidal. Após a recombinação, a região da alça é retida no cromossomo na orientação invertida.

Question 22

A diversidade clonal é gerada por 4 processos principais: diversidade combinatória (2 processos), diversidade juncional e hipermutação somática. Como se dá a diversidade combinatória?

Answer 22

1- Há múltiplas cópias diferentes de cada tipo de fragmento gênico (V, D, J e fragmentos C). A combinação entre esses segmentos gera diferentes imunoglobulinas.

2- A diversidade combinatória surge também nas inúmeras combinações possíveis que pode ocorrer no pareamento de diferentes regiões V de cadeias leves e pesadas para formar o sítio de ligação ao antígeno nos anticorpos.

Question 23

A diversidade clonal é gerada por 4 processos principais: diversidade combinatória (2 processos), diversidade juncional e hipermutação somática. Como se dá a diversidade juncional?

Answer 23

Nesse casos a diversidade ocorre pela introdução ou deleção aleatória de nucleotídeos P (palíndromos) e N (adicionadas pelas enzimas TdT) na junções entre os diferentes segmentos gênicos.

Question 24

A diversidade clonal é gerada por 4 processos principais: diversidade combinatória (2 processos), diversidade juncional e hipermutação somática. Como se dá a hipermutação somática?

Answer 24

Mutação ocasionada pela desaminação da citidina na região variável pela AID. Nesse caso, introduz-se mutações pontuais nos genes das regiões V rearranjadas das células B ativadas, criando-se um diversidade juncional ainda maior, que pode ser selecionada para aumentar a afinidade de ligação ao antígeno.

Question 25

Em qual órgão ocorre a recombinação somática dos dos TCRs?

Answer 25

Ocorre no Timo

Question 26

O que são TRECs( Circulos de excisão de receptor de células T)?

Answer 26

São DNA’s circulares que surgem dos rearranjos gênicos dos TCRs. Eles são marcadores de células T recentemente migradas para o timo.

Question 27

Como as imunoglobulinas de todas as classes podem ser produzidas na sua forma secretada e na sua forma de receptores transmembrana?

Answer 27

As formas secretadas e transmembranas das imunoglobulinas são geradas a partir de transcritos alternativos de cadeias pesadas.

Os últimos 2 éxons de cada gene Ch (Cmi, Cdelta, Calfa…) contém as sequências que codificam as regiões secretadas e transmembrana respectivamente:

 * Se o transcrito primário é secretado e poliadenilado após esses dois éxons, a sequência carboxiterminal responsável pela forma secretada será retirada por splicing alternativo e então restará apenas a forma de superfície celular. 
* Se o transcrito primário for clivado e poliadenilado antes dos dois éxons, somente a forma secretada será produzida.

Question 28

Quais são os primeiros 2 genes da região constante da cadeia pesada das imunoglobulinas usadas inicialmente pelas células B virgens?

Answer 28

Inicialmente as células B virgens utilizam somente os primeiros 2 genes, o Cmi e o Cdelta, os quais são expressos com uma sequência de região V já unida associada a eles para produzir IgM e IgD de transmembrana na superfície das células B virgens.

Question 29

Por que cada gene Ch (Cmi, Cdelta, Cgama…) é dividido é vário éxons?

Answer 29

Pois cada éxon corresponde a um domínio específico da imunoglobulina na região C dobrada (CH1, CH2 e CH3).

Question 30

Como ocorre a coexpresão da IgD e da IgM na superfície de quase todas as célula B maduras?

Answer 30

Essas células produze um longo transcrito primário de RNAm diferencialmente clivado e processado para produzir uma de 2 moléculas de RNAm distintas.

 * Em um delas o éxon VDJ é unido ao éxon Cmi, ´para produzir a IgM. 
 * Em outra, o éxon VDJ é unido ao éxon Cdelta para produzir o IgD. 

O processamento ao longo do transcrito de RNAm é regulado durante o desenvolvimento das células B: As células B imaturas fazem em sua maioria transcritos “mi”, e as células B maduras fazem transcritos “delta” e um pouco de “mi”.

Quando a célula B é ativada, ela perde a coexpressão de IgD e IgM.

Question 31

Qual a diferença entre a diversificação primária e secundária do repertório de anticorpos.

Answer 31

A diversificação primária ocorre com o rearranjo gênico V(D)J durante o desenvolvimento dos linfócitos B e T na medula óssea. São necessárias as enzimas RAG 1 e RAG 2.

A diversificação secundária ocorre somente nas células B já maduras e ativadas pelo antígeno. Essa diversificação pode se dá por meio de 3 mecanismos: hipermutação somática, troca de classe e conversão gênica. É necessária a enzima AID.

Question 32

O que é hipermutação somática?

Answer 32

É um mecanismo que introduz mutações de ponto na região V das duas cadeias das imunoglobulinas, que altera a afinidade do anticorpo para o antígeno.

Question 33

O que é recombinação de troca de classe?

Answer 33

É uma recombinação que envolve apenas a região constante da cadeia pesada das imunoglobulinas, em que há uma substituição da cadeia Cmi por uma outra região alternativa (Cgama, Calfa…), aumentando assim a diversidade funcional das imunoglobulinas.

Question 34

Como a AID induz a hipermutação somática ou a recombinação de troca de classe?

Answer 34

A AID funciona desaminando um resíduo de citidina. Se esse resíduo se encontrar na região V da imunoglobulina, inicia-se a hipermutação somática. Contudo, se esse resíduo se encontrar nas regiões de troca, inicia-se a recombinação de troca de classe.

Question 35

Quais são as consequências (boas e ruins) da hipermutação somática?

Answer 35

Ruim –> a mutação de ponto pode alterar a matriz de leitura dos aminoácidos, causando, assim, a perda da forma da estrutura da imunoglobulina e a sua consequente destruição.

Boa –> mutações favoráveis podem aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno, e os clones de células B que produzem receptores com afinidade mais alta pelo antígeno são favorecidos para sobreviver.

Question 36

Como é possível que toda a progênie de uma linfócito B expresse o mesmo gene VH?

Answer 36

Os éxons VH expressos por uma célula B são determinados durante a diferenciação na medula óssea e, embora possam ser modificados posteriormente por hipermutação somática, não há mais recombinação dos segmentos V(D)J. Assim, por meio da troca de classe, um mesmo éxon VH pode se associar a diferentes genes CH durante a resposta imune.

Question 37

Como é possível que vários isotipos da região C diferentes possam ser expressos pela progênie de uma célula B?

Answer 37

Isso é possível através da recombinação por troca de classe.

Os primeiros receptores de antígenos de uma célula B são o IgM e o IgD, e o primeiro anticorpo produzido durante a resposta imune é sempre o IgM. Mais tarde, na resposta imune, entretanto, a mesma região V unida pode ser expressas em anticorpos IgG, IgA e IgE. Isso é estimulado durante uma resposta imune por sinais externos, como citocinas liberadas por células T ou sinais mitogênicos liberados por patógenos.

Question 38

Como se dá o mecanismo de troca de classe?

Answer 38

Quando o linfócito B troca a coexpressão de IgM e IgD para expressar outro subtipo, ocorre recombinação do DNA entre “Smi” e a região “S” imediatamente a montante do gene desse isotipo (Salfa, Sgama…).

Em tal evento de recombinação, a região “Cdelta” e todo o DNA interveniente são deletados entre ela a região S que sofreu o rearranjo.

Question 39

Quais as diferenças entre a recombinação de troca de classe e a recombinação V(D)J?

Answer 39

• Toda recombinação por troca de classe é produtiva;
• A recombinação por troca de classe utiliza RSS, mas não utiliza enzimas RAG;
• A recombinação por troca de classe ocorre após o estímulo antigênico e não durante o desenvolvimento da célula B na medula óssea;
• O processo de troca de classe não ocorre ao acaso, mas é regulado por sinais externos, como aqueles emitidos pelas células T.