Diagnóstico molecular Flashcards
O que é um polimorfismo? O que é que determina se aquela variação na sequência do genoma é um polimorfismo ou uma mutação?
Múltiplas formas de uma única região específica do genoma que existe em um indivíduo ou entre um grupo de indivíduos. Pode ser separada em classes distintas e bem definidas, por exemplo, os grupos sanguíneos do sistema ABO. A frequência, para ser polimorfismo, o alelo ou característica deve estar presente em ao menos 1% da população. Abaixo disso, já digo que é uma mutação.
Como se dá o diagnóstico a nível de rna?
Analiso o transcriptoma (o conjunto completo de transcritos). Vejo o quanto aquele gene está sendo transcrito. (Nothern blot;Microarrays- Técnica de microarranjos;Differential display).
Como se dá o diagnóstico a nível de proteínas?
Analiso o proteoma, verificando quais proteínas estão sendo produzidas e em que quantidade. Complementar com a análise transcriptômica. Bom fazer os dois porque sabemos os RNAs produzidos e no que isso tá dando – se está resultando na proteína ou não.
Cariótipo?
Geralmente, feito em leucócitos. Serve para verificar uma doença cromossômica. Fotomicrografia de cromossomos de um indivíduo, visando o diagnóstico de anomalias genéticas relacionadas ao número ou à morfologia de cromossomos.
Extração de DNA ?
Tem um custo barato e é fácil. Células da mucosa oral ou saliva, sangue, tecidos frescos (peles, tumores, aborto, biopsia), tecidos fixados em álcool, formol ou parafina.
PCR?
Material genético do indivíduo é levado ao termociclador (temperatura de 95) para a dupla hélice ser desnaturada. Ligação dos primers nas sequências complementares, funcionando como modelo para replicação. Na etapa seguinte, é a ação da taq polimerase que faz a cadeia complementar. Isso constitui o primeiro ciclo e são feitos outros para alcançar quantidade alvo, é limitada até um número de ciclos que satura.
RT- PCR?
PCR não convencional que analisa amostras de RNA.
Usam a transcriptase reversa para ler a sequência de RNA dos famosos “vírus de RNA”, como HIV, dengue, e sintetiza uma cadeia de DNA complementar, seguida de reação em cadeia da polimerase. Com isso fazemos diagnósticos de vírus que usam RNA como material genético. É mais rápido e ainda informa a cepa do vírus (no caso da influenza é usado para isso).
MLPA?
Detecta deleções ou duplicações de exons/ material genético. Detecta trissomias. Técnica barata. Chega a nível de gene, mas não de nucleotídeo. As sondas, de tamanhos diferentes, são especificamente posicionadas nos genes, de forma uniforme, permitindo a amplificação somente das sondas que se ligaram às regiões alvo.
Diagnóstico de doenças mendelianas?
A hipótese é formulada pelo fenótipo verificada na clínica/ anamnese. Determinar o padrão de herança (entrevistar os parentes para ver se tem recorrência. Usa-se heredograma). Escolha da técnica - cariótipo para mutação cromossômica e sequenciamento/ ngs para mutação gênica.
Sequenciamento de sanger?
Sequenciamento das bases nitrogenadas. Primeiro desnaturo e separo a dupla hélice (pelo aumento de temperatura). Depois, eu misturo a fita de DNA, com um prime, dnapolimerase e dNTPs (formarão os nucleotídeos) e ddNTPs (formará o nucleotídeo de parada) em vários tubos. Formam-se DNAs de tamanhos diferentes. Realiza uma eletroforese. Na menor cadeia (a mais inferior), seu ddntp representa a primeira base da cadeia original e assim por diante até o mais superior.
Polimorfismo funcional e não funcional?
Funcional - região codificante. Não funcional- região não codificante.
Sequenciamento NGS (sequenciamento de nova geração)?
o método de Sanger ainda utilizado é sem escalabilidade, bastante trabalhoso e demorado. Diferente dele, o NGS tem alta potência, possui várias metodologias proporcionam o sequenciamento direto e paralelo de milhões e bilhões de moléculas de DNA, aumentando consideravelmente a escala e a resolução das análises.
Exoma médico?
Análise de sequências codantes/exomas (até 20 000 genes). Envolve a bioética médica quando se utiliza em teste pré-implantacional. Um preço alto (8.000). O SUS não abarca.
FISH?
Consiste no anelamento da sonda com a sequência alvo, para a visualização em microscópio epifluorescente. Entende-se por sonda, uma sequência de oligonucleotídeos complementares e específicos marcados com substâncias fluorescentes os quais se anelarão ao alvo. Preparação da lâmina - hibridização - lavagem de sondas em excesso - visualização. Ele diz exatamente onde houve a perda do cromossomo. Quando eu já tenho uma hipótese. Detecta anomalias cromossômicas como microdeleções e rearranjos complexos, que estão além do poder de resolução da citogenética clássica. Além disso detecta câncer, como por exemplo a quantidade de HER (proto-oncogene) presente em grande quantidade no câncer de mama
AcCG?
Sonda fluorescentes, lidas por um sfotware. São colhidas amostras dos pais e do indivíduo. Permite o diagnóstico de trissomia ou monossomia pela análise de TODOS OS CROMOSSOMOS; TRIPLOIDIA e também de TETRAPLOIDIA; diagnóstico de MICRODELEÇÕES e MICRODUPLICAÇÕES; diagnóstico de 100% das TRANSLOCAÇÕES NÃO-BALANCEADAS; diagnóstico de UPD – DISSOMIA UNIPARENTAL (isodissomia e heterodissomia)
