Diagnóstico molecular Flashcards
O que é um polimorfismo? O que é que determina se aquela variação na sequência do genoma é um polimorfismo ou uma mutação?
Múltiplas formas de uma única região específica do genoma que existe em um indivíduo ou entre um grupo de indivíduos. Pode ser separada em classes distintas e bem definidas, por exemplo, os grupos sanguíneos do sistema ABO. A frequência, para ser polimorfismo, o alelo ou característica deve estar presente em ao menos 1% da população. Abaixo disso, já digo que é uma mutação.
Como se dá o diagnóstico a nível de rna?
Analiso o transcriptoma (o conjunto completo de transcritos). Vejo o quanto aquele gene está sendo transcrito. (Nothern blot;Microarrays- Técnica de microarranjos;Differential display).
Como se dá o diagnóstico a nível de proteínas?
Analiso o proteoma, verificando quais proteínas estão sendo produzidas e em que quantidade. Complementar com a análise transcriptômica. Bom fazer os dois porque sabemos os RNAs produzidos e no que isso tá dando – se está resultando na proteína ou não.
Cariótipo?
Geralmente, feito em leucócitos. Serve para verificar uma doença cromossômica. Fotomicrografia de cromossomos de um indivíduo, visando o diagnóstico de anomalias genéticas relacionadas ao número ou à morfologia de cromossomos.
Extração de DNA ?
Tem um custo barato e é fácil. Células da mucosa oral ou saliva, sangue, tecidos frescos (peles, tumores, aborto, biopsia), tecidos fixados em álcool, formol ou parafina.
PCR?
Material genético do indivíduo é levado ao termociclador (temperatura de 95) para a dupla hélice ser desnaturada. Ligação dos primers nas sequências complementares, funcionando como modelo para replicação. Na etapa seguinte, é a ação da taq polimerase que faz a cadeia complementar. Isso constitui o primeiro ciclo e são feitos outros para alcançar quantidade alvo, é limitada até um número de ciclos que satura.
RT- PCR?
PCR não convencional que analisa amostras de RNA.
Usam a transcriptase reversa para ler a sequência de RNA dos famosos “vírus de RNA”, como HIV, dengue, e sintetiza uma cadeia de DNA complementar, seguida de reação em cadeia da polimerase. Com isso fazemos diagnósticos de vírus que usam RNA como material genético. É mais rápido e ainda informa a cepa do vírus (no caso da influenza é usado para isso).
MLPA?
Detecta deleções ou duplicações de exons/ material genético. Detecta trissomias. Técnica barata. Chega a nível de gene, mas não de nucleotídeo. As sondas, de tamanhos diferentes, são especificamente posicionadas nos genes, de forma uniforme, permitindo a amplificação somente das sondas que se ligaram às regiões alvo.
Diagnóstico de doenças mendelianas?
A hipótese é formulada pelo fenótipo verificada na clínica/ anamnese. Determinar o padrão de herança (entrevistar os parentes para ver se tem recorrência. Usa-se heredograma). Escolha da técnica - cariótipo para mutação cromossômica e sequenciamento/ ngs para mutação gênica.
Sequenciamento de sanger?
Sequenciamento das bases nitrogenadas. Primeiro desnaturo e separo a dupla hélice (pelo aumento de temperatura). Depois, eu misturo a fita de DNA, com um prime, dnapolimerase e dNTPs (formarão os nucleotídeos) e ddNTPs (formará o nucleotídeo de parada) em vários tubos. Formam-se DNAs de tamanhos diferentes. Realiza uma eletroforese. Na menor cadeia (a mais inferior), seu ddntp representa a primeira base da cadeia original e assim por diante até o mais superior.
Polimorfismo funcional e não funcional?
Funcional - região codificante. Não funcional- região não codificante.
Sequenciamento NGS (sequenciamento de nova geração)?
o método de Sanger ainda utilizado é sem escalabilidade, bastante trabalhoso e demorado. Diferente dele, o NGS tem alta potência, possui várias metodologias proporcionam o sequenciamento direto e paralelo de milhões e bilhões de moléculas de DNA, aumentando consideravelmente a escala e a resolução das análises.
Exoma médico?
Análise de sequências codantes/exomas (até 20 000 genes). Envolve a bioética médica quando se utiliza em teste pré-implantacional. Um preço alto (8.000). O SUS não abarca.
FISH?
Consiste no anelamento da sonda com a sequência alvo, para a visualização em microscópio epifluorescente. Entende-se por sonda, uma sequência de oligonucleotídeos complementares e específicos marcados com substâncias fluorescentes os quais se anelarão ao alvo. Preparação da lâmina - hibridização - lavagem de sondas em excesso - visualização. Ele diz exatamente onde houve a perda do cromossomo. Quando eu já tenho uma hipótese. Detecta anomalias cromossômicas como microdeleções e rearranjos complexos, que estão além do poder de resolução da citogenética clássica. Além disso detecta câncer, como por exemplo a quantidade de HER (proto-oncogene) presente em grande quantidade no câncer de mama
AcCG?
Sonda fluorescentes, lidas por um sfotware. São colhidas amostras dos pais e do indivíduo. Permite o diagnóstico de trissomia ou monossomia pela análise de TODOS OS CROMOSSOMOS; TRIPLOIDIA e também de TETRAPLOIDIA; diagnóstico de MICRODELEÇÕES e MICRODUPLICAÇÕES; diagnóstico de 100% das TRANSLOCAÇÕES NÃO-BALANCEADAS; diagnóstico de UPD – DISSOMIA UNIPARENTAL (isodissomia e heterodissomia)
Testes de expressão gênica de tumor estão disponíveis no mercado, por exemplo?
Mammaprint (avalia o risco de metástase), FoundationOne (sequenciamento de genes relacionados com carcinogênese), oncotype (indica o risco de recorrência em 10 anos, prediz o benefício da quimioterapia) e etc…
Exemplos de terapia alvo?
hormonioterapia (bloqueia os efeitos dos hormônios, pois o câncer usa esses hormônios para crescer), moduladores da expressão gênica, indutores de apoptose, imunoterapias (tem o objetivo de potencializar o sistema imunológico de maneira a que este possa combater o câncer)…
Testes genéticos para identificar o alvo e sua importância?
ish, sequenciamento sanger, qPCR, sequenciamento ngs…
Importantes para detectar fusão gênica como BCR/ABL(cromossomo filadélfia- leucemia), EML4/ALK (câncer de pulmão), analisando o tipo de câncer.
SNP?
Um polimorfismo configurado pela variação de um único nucleotídeo (base). Dependendo da base/ nucleotídeo diferente pode reproduzir uma sintomatologia diferente.
Polimorfismos de sequências repetidas curtas em regiões não gênicas (servem para identificação do indivíduo)/ STR?
Sequências curtas que se repetem, a sua quantidade varia de indivíduo para indivíduo, ou seja, o polimorfismo está baseado no número de repetições, o que nos permite diferenciá-los. Alelos podem ser analisados após amplificação pela técnica PCR.
Regiões polimórficas do tipo VNTR?
repetições de número variável. Com exceção de gêmeos univitelinos, ocorre uma enorme variação dessa região nos indivíduos. O padrão de fragmentos é característico e herdado por indivíduos geneticamente relacionados, uma vez que a localização dos sítios de restrição é típica. Desta forma, por locus, cada sonda hibridiza com dois segmentos de DNA, correspondentes aos alelos materno e paterno de cada indivíduo (por muito tempo foi uma técnica usada para testes de paternidade). Região obtida a partir de enzimas de restrição.
diagnóstico de anemia falciforme?
Trata-se de uma mutação recessiva em que na troca de um a por um T, elimina um lugar de corte para as enzimas de restrição (enzima MstII), fazendo com que a cadeia seja cortada em menos pedaços. Verificamos isso na eletroforese. Existe a tecnica de RFLP e a de Southern blotting (mais preciso para obter regiões alvos)
Diagnóstico molecular- anemia falciforme?
Teste de falcização (colocar a hemácia em uma condição de estresse). Técnica de Southern blotting (Melhoramento da RFLP, a diferença é que faz o uso de sondas. Eletroforese um dos passos dela, faz com PCR, mas nem sempre é obrigatório. É possível detectar fragmentos de DNA específicos (sequências-alvo) em amostras de composição complexa). É possível discernir, assim, indivíduos com traço falcêmico, acometidos e normais.
RFLP?
usada para diagnosticar anemia falciforme. Enzimas de restrição e joga no gel de agarose e faz a eletroforese.
