Cromatografia Liquida HPLC Flashcards
Contenitori per la fase mobile
Una moderna apparecchiatura LC e dotata di uno o più contenitori di vetro, ciascuno dei quali può contenere 500 mL o più di solvente. I contenitori sono spesso equipaggiati da un sistema di allontanamento dei gas e della polvere dai liquidi
Che problemi possono causare i gas disciolti e la polvere nei solventi?
I gas disciolti possono portare a velocità di flusso non riproducibili e ed allargamento della banda; inoltre, sia le bolle di gas he la polvere interferiscono con il funzionamento della maggior parte dei rilevatori
Sistemi per il trattamento dei solventi: sistemi di degassamento
Possono consistere in una pompa da vuoto, in un sistema di distillazione, in un sistema per riscaldare e agitare il solvente, oppure in un sistema a gorgogliamento, in cui i gas disciolti vengono eliminati dalla soluzione mediante un flusso di piccole bolle di un gas inerte insoluble nella fase mobile
Sistemi per il trattamento dei solventi: sistemi di filtrazione
Eliminano la polvere e il materiale particolato sospesi nel solvente, per evitare che tali particelle danneggino il sistema di pompaggio o di iniezione o provochino occlusioni della colonna
È necessario che i degassatori e i filtri siano integrante del sistema per HPLC?
No
Eluizione isocratica
Eluizione che si ottiene con un singolo solvente o miscela di solventi di composizione costante.
Eluizione a gradiente
In essa si usano due o più sistemi solventi a polarità molto diversa, che variano di composizione durante la separazione. Il rapporto tra i due solventi viene variato in modo programmato, a volte in modo continuo e a volte con una variazione a gradini. I moderni strumenti per HPLC sono dotati molto spesso di valvole che permettono l’ingresso dei liquidi da due o più contenitori secondo rapporti che possono essere variati continuamente. Il rapporto tra i volumi dei solventi può essere cambiato linearmente o esponenzialmente
Perchè l’eluizione a gradiente è più conveniente rispetto a quella isocratica?
L’eluizione a gradiente abbrevia notevolmente il tempo di separazione sends sacrificare la risoluzione dei primi picchi. Produce inoltre effetti simili a quelli che si hanno con a programmazione della temperatura in gascromatografia
Che requisiti devono avere le pompe per la cromatografia liquida?
Comprendono:
1) capacita di esercitare elevate pressioni di esercizio (fino a 6000 psi o 414 bar)
2) flusso di eluente costante e privo di pulsazioni
3) velocità di flusso che variano tra 0,1 e 10 mL/min
4) possibilità di realizzare gradienti con ottima riproducibilità ( almeno 5%)
5) resistenza alla corrosione da parte di una varietà do solventi
C’è pericolo di esplosioni creato dalle elevate pressioni generate dalle pompe per cromatografia liquida ?
No, perchè i liquidi non sono molto comprimibili. La rottura di un componente del sistema può portare solo a perdite di solvente
Quali sono le pompe più adatte per HPLC
1) pompe a siringa ( o spostamento ), non utilizzate a causa della loro bassa capacita di solvente
2) pompe reciprocanti a singola testa, in cui il solvente viene pompato dal movimento avanti e indietro di un pistone. Svantaggio= flusso pulsato
3) pompe reciprocanti a doppia testa, le più utilizzate
Pompe reciprocanti a singola testa
Sono formate, di solito, da una piccola camera in cui il solvente viene pompato al movimento avanti e indietro di un pistone spinto da un motore. Due valvole di controllo, che si aprono e si chiudono in modo alternato, controllano il flusso del solvente in ingresso e in uscita dal cilindro.
Il solvente è a diretto contatto con il pistone. Oppure, la pressione può essere trasmessa al solvente per ,Enzo di un diaframma flessibile, che a sua volta viene compresso idraulicamente con un pistone reciprocante
Qual è lo svantaggio delle pompe reciprocanti a singola testa?
Quello di produrre un flusso pulsato, che deve essere smorzato perché la sua presenza si manifesta come un rumore sulla linea di base del cromatogramma. Per ridurre al minimo queste pulsazioni, i moderni strumenti utilizzano teste a doppia pompa o canne ellittiche
Quali sono i vantaggi delle pompe reciprocanti?
1) piccolo volume interno
2) elevati pressioni in uscita
3) adattabilità all’eluizione a gradiente
4) velocità di flusso costanti, indipendenti dalla contropressione della colonna e dalla viscosità del solvente
Pompa reciprocante a doppia testa
È come se fosse formata da due pompe a singola testa su cui agisce un unico pistone.
A causa del movimento alternato del pistone, quando una camera si svuota l’altra si riempie, garantendo un flusso continuo.
Inoltre, essendo sfalsate, le due pompe danno luogo a impulsi di intensità minore
Pompe a spostamento
Consistono in ampie camere a forma di siringa munite di un pistone attivato da un meccanismo a vite alimentato da un motore a passi.
Quali sono i vantaggi delle pompe a sostamento?
1) Producono un flusso che tende ad essere indipendente dalla viscosità e dalla contropressione
2) Il segnale in uscita è esente da pulsazioni
Quali sono gli svantaggi delle pompe a spostamento?
1) Limitata capacità per il solvente
2) inconvenienti non trascurabili quando si cambiano i solventi
Come viene controllato il flusso?
Attraverso dispostivi a controllo elettronico per misurare la velocità del flusso determinando la caduta di pressione attraverso un restrittive collocato all’uscita della pompa.
Qualsiasi differenza di segnale rispetto ad un valore prefissato viene usata per incrementare o diminuire la velocità del motore della pompa
Come viene variata la composizione?
Attraverso un sistema per variare la composizione i modo continuo o a gradini
Qual è spesso un fattore che limita la precisione delle misure ottenute con HPLC?
La riproducibilità con cui i campioni possono essere introdotti sull’impaccammento della colonna. Il problema è incrementato dal l’allargamento della banda, che accompagna il tappo provocato da un’introduzione del campione troppo lunga
Qual’e il metodo più diffuso per l’introduzione dei campioni ?
Si basa su anelli ( loop). Tali dispositivi sono spesso parte integrante del dispositivo cromatografico liquido ed hanno loop intercambiabili che consentono di scegliere le dimensioni del campione ( da 1 µL a 100 µL )
Cosa sono gli autoiniettori?
Sono apparecchi che permettono di introdurre il LC campioni da fiale poste su una giostra per campioni o da piatti per microtitoli.
Essi contengono di solito campionatori ed una pompa a siringa per introdurre volumi che vallo da meno di 1 µL a più di 1 mL.
Alcuni hanno ambienti a temperatura controllata che permettono di conservare il campione ed eseguire, prima di introdurlo, reazioni di derivatizzazione
Da cosa sono costituite, di solito, le colonne per HPLC?
Da tubi levigati in acciaio, ma talvolta si usano tubi di vetro a parete spessa e tubi di polimeri come il PEEK. Sono inoltre disponibili colonne di acciaio inossidabile rivestite con vetro o PEEK
