Cromatografia Liquida HPLC

Question 1

Contenitori per la fase mobile

Answer 1

Una moderna apparecchiatura LC e dotata di uno o più contenitori di vetro, ciascuno dei quali può contenere 500 mL o più di solvente. I contenitori sono spesso equipaggiati da un sistema di allontanamento dei gas e della polvere dai liquidi

Question 2

Che problemi possono causare i gas disciolti e la polvere nei solventi?

Answer 2

I gas disciolti possono portare a velocità di flusso non riproducibili e ed allargamento della banda; inoltre, sia le bolle di gas he la polvere interferiscono con il funzionamento della maggior parte dei rilevatori

Question 3

Sistemi per il trattamento dei solventi: sistemi di degassamento

Answer 3

Possono consistere in una pompa da vuoto, in un sistema di distillazione, in un sistema per riscaldare e agitare il solvente, oppure in un sistema a gorgogliamento, in cui i gas disciolti vengono eliminati dalla soluzione mediante un flusso di piccole bolle di un gas inerte insoluble nella fase mobile

Question 4

Sistemi per il trattamento dei solventi: sistemi di filtrazione

Answer 4

Eliminano la polvere e il materiale particolato sospesi nel solvente, per evitare che tali particelle danneggino il sistema di pompaggio o di iniezione o provochino occlusioni della colonna

Question 5

È necessario che i degassatori e i filtri siano integrante del sistema per HPLC?

Answer 5

No

Question 6

Eluizione isocratica

Answer 6

Eluizione che si ottiene con un singolo solvente o miscela di solventi di composizione costante.

Question 7

Eluizione a gradiente

Answer 7

In essa si usano due o più sistemi solventi a polarità molto diversa, che variano di composizione durante la separazione. Il rapporto tra i due solventi viene variato in modo programmato, a volte in modo continuo e a volte con una variazione a gradini. I moderni strumenti per HPLC sono dotati molto spesso di valvole che permettono l’ingresso dei liquidi da due o più contenitori secondo rapporti che possono essere variati continuamente. Il rapporto tra i volumi dei solventi può essere cambiato linearmente o esponenzialmente

Question 8

Perchè l’eluizione a gradiente è più conveniente rispetto a quella isocratica?

Answer 8

L’eluizione a gradiente abbrevia notevolmente il tempo di separazione sends sacrificare la risoluzione dei primi picchi. Produce inoltre effetti simili a quelli che si hanno con a programmazione della temperatura in gascromatografia

Question 9

Che requisiti devono avere le pompe per la cromatografia liquida?

Answer 9

Comprendono:

1) capacita di esercitare elevate pressioni di esercizio (fino a 6000 psi o 414 bar)
2) flusso di eluente costante e privo di pulsazioni
3) velocità di flusso che variano tra 0,1 e 10 mL/min
4) possibilità di realizzare gradienti con ottima riproducibilità ( almeno 5%)
5) resistenza alla corrosione da parte di una varietà do solventi

Question 10

C’è pericolo di esplosioni creato dalle elevate pressioni generate dalle pompe per cromatografia liquida ?

Answer 10

No, perchè i liquidi non sono molto comprimibili. La rottura di un componente del sistema può portare solo a perdite di solvente

Question 11

Quali sono le pompe più adatte per HPLC

Answer 11

1) pompe a siringa ( o spostamento ), non utilizzate a causa della loro bassa capacita di solvente
2) pompe reciprocanti a singola testa, in cui il solvente viene pompato dal movimento avanti e indietro di un pistone. Svantaggio= flusso pulsato
3) pompe reciprocanti a doppia testa, le più utilizzate

Question 12

Pompe reciprocanti a singola testa

Answer 12

Sono formate, di solito, da una piccola camera in cui il solvente viene pompato al movimento avanti e indietro di un pistone spinto da un motore. Due valvole di controllo, che si aprono e si chiudono in modo alternato, controllano il flusso del solvente in ingresso e in uscita dal cilindro.
Il solvente è a diretto contatto con il pistone. Oppure, la pressione può essere trasmessa al solvente per ,Enzo di un diaframma flessibile, che a sua volta viene compresso idraulicamente con un pistone reciprocante

Question 13

Qual è lo svantaggio delle pompe reciprocanti a singola testa?

Answer 13

Quello di produrre un flusso pulsato, che deve essere smorzato perché la sua presenza si manifesta come un rumore sulla linea di base del cromatogramma. Per ridurre al minimo queste pulsazioni, i moderni strumenti utilizzano teste a doppia pompa o canne ellittiche

Question 14

Quali sono i vantaggi delle pompe reciprocanti?

Answer 14

1) piccolo volume interno
2) elevati pressioni in uscita
3) adattabilità all’eluizione a gradiente
4) velocità di flusso costanti, indipendenti dalla contropressione della colonna e dalla viscosità del solvente

Question 15

Pompa reciprocante a doppia testa

Answer 15

È come se fosse formata da due pompe a singola testa su cui agisce un unico pistone.
A causa del movimento alternato del pistone, quando una camera si svuota l’altra si riempie, garantendo un flusso continuo.
Inoltre, essendo sfalsate, le due pompe danno luogo a impulsi di intensità minore

Question 16

Pompe a spostamento

Answer 16

Consistono in ampie camere a forma di siringa munite di un pistone attivato da un meccanismo a vite alimentato da un motore a passi.

Question 17

Quali sono i vantaggi delle pompe a sostamento?

Answer 17

1) Producono un flusso che tende ad essere indipendente dalla viscosità e dalla contropressione
2) Il segnale in uscita è esente da pulsazioni

Question 18

Quali sono gli svantaggi delle pompe a spostamento?

Answer 18

1) Limitata capacità per il solvente

2) inconvenienti non trascurabili quando si cambiano i solventi

Question 19

Come viene controllato il flusso?

Answer 19

Attraverso dispostivi a controllo elettronico per misurare la velocità del flusso determinando la caduta di pressione attraverso un restrittive collocato all’uscita della pompa.
Qualsiasi differenza di segnale rispetto ad un valore prefissato viene usata per incrementare o diminuire la velocità del motore della pompa

Question 20

Come viene variata la composizione?

Answer 20

Attraverso un sistema per variare la composizione i modo continuo o a gradini

Question 21

Qual è spesso un fattore che limita la precisione delle misure ottenute con HPLC?

Answer 21

La riproducibilità con cui i campioni possono essere introdotti sull’impaccammento della colonna. Il problema è incrementato dal l’allargamento della banda, che accompagna il tappo provocato da un’introduzione del campione troppo lunga

Question 22

Qual’e il metodo più diffuso per l’introduzione dei campioni ?

Answer 22

Si basa su anelli ( loop). Tali dispositivi sono spesso parte integrante del dispositivo cromatografico liquido ed hanno loop intercambiabili che consentono di scegliere le dimensioni del campione ( da 1 µL a 100 µL )

Question 23

Cosa sono gli autoiniettori?

Answer 23

Sono apparecchi che permettono di introdurre il LC campioni da fiale poste su una giostra per campioni o da piatti per microtitoli.
Essi contengono di solito campionatori ed una pompa a siringa per introdurre volumi che vallo da meno di 1 µL a più di 1 mL.
Alcuni hanno ambienti a temperatura controllata che permettono di conservare il campione ed eseguire, prima di introdurlo, reazioni di derivatizzazione

Question 24

Da cosa sono costituite, di solito, le colonne per HPLC?

Answer 24

Da tubi levigati in acciaio, ma talvolta si usano tubi di vetro a parete spessa e tubi di polimeri come il PEEK. Sono inoltre disponibili colonne di acciaio inossidabile rivestite con vetro o PEEK

Question 25

Quali sono generalmente le dimensioni delle colonne per cromatografia liquida ?

Answer 25

La maggior parte delle colonne ha una lunghezza compresa tra 5 e 25 cm, si usano sempre colonne dritte; la lunghezza viene aumentata accoppiando due o piu colonne. Il diametro è compreso tra 3 e 5 mm, la dimensione particellare più comune è 3 o 5 µm.
Le colonne più comuni hanno una lunghezza di 10 cm, un diametro interno di 4,6 cm, e sono impaccate con particelle da 5 µm

Question 26

Come viene controllata la temperatura della colonna ?

Answer 26

Spesso si ottengono dei cromatogrammi più riproducibili mantenendo la temperatura costante; infatti la maggior parte dei comuni strumenti e dotata di termostati che controllano le temperature della colonna . Si possono anche inserire le colonne in camicie di termostatazione ad acqua per ottenere un preciso controllo della temperatura

Question 27

Che tipi di impaccamenti vengono usati in cromatografia liquida?

Answer 27

Principalmente due tipi:

1) a particelle pellicolari
2) a particelle porose

Question 28

Impaccamento a particelle pellicolari

Answer 28

In origine erano granuli sferici, non porosi, di vetro o polimeri con diametri tipici compresi tra 30 e 40 µm. Sulla superficie di questi granuli si deposita un sottile strato poroso di silice, allumina, una resina sintetica del polistirene-divinil-benzene o una resina a scambio ionico.
Queste grandi particelle pellicolari sono state completamente rimpiazzate dale piccole microparticelle porose, anche se negli ultimi anni, piccoli impaccamenti pellicolari sono stati reintrodotti per separare proteine e grandi biomolecole

Question 29

Impaccamento a particelle porose

Answer 29

È formato da microparticelle porose con diametro compreso tra 3 e 10 µm. Le particelle sono composte da silice, allumina, una resina sintetica del polistirene-divinil-benzene o una resina a scambio ionico.