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bio 1153 > Cours 2: Microscopie > Flashcards

Cours 2: Microscopie Flashcards

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1
Q

Qu’est-ce qu’un artéfact en biologie cellulaire ?

A

Structure artificielle apparaissant lors de la préparation de l’échantillon pour son observation au microscope.

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Q

Qu’est-ce qui peut causer des artéfacts lors de la préparation d’un échantillon pour l’observation au microscope ?

A

Les fixateurs, qui peuvent causer la précipitation ou la coagulation de substances normalement dépourvues de structure dans la cellule.

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Q

Comment peut-on prouver qu’une structure observée au microscope n’est pas un artéfact ?

A

En préparant les échantillons de différentes façons, en utilisant différents fixateurs ou en ne les fixant pas du tout (congélation rapide et cryodécapage).

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4
Q

Qu’est-ce que le grossissement efficace en microscopie ?

A

donne de l’information à partir du grossissement

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Q

Qu’est-ce que le grossissement stérile en microscopie ?

A

limite de résolution atteinte, donc pas plus d’informations

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6
Q

Qu’est-ce que la limite de résolution en optique ?

A

expression quantitative de la capacité de grossissement efficace d’un appareil optique.

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7
Q

Comment est définie la limite de résolution (d) ?

A

distance minimale (d) (centre à centre) de 2 points qui peuvent être distingués comme tels.

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8
Q

Quelle est la formule pour calculer la limite de résolution (d) ?

A

d = 0.61λ / O.N. = 0.61λ / n sin α, où O.N. ouverture numérique et n indice de réfraction

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9
Q

Comment la diminution de la longueur d’onde affecte-t-elle la limite de résolution ?

A

La diminution de la longueur d’onde améliore la limite de résolution.

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10
Q

Comment peut-on améliorer la limite de résolution en lumière visible ?

A

En éclairant la préparation avec de courtes longueurs d’onde (ex. lumière bleu)

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11
Q

Quel est le meilleur microscope en rapport à la limite de résolution?

A

Microscope UV.
À 200 nm, on réussit à baisser de moitié la limite de résolution par rapport à la lumière visible (400 nm).

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12
Q

Quels sont les inconvénients à utiliser la lumière ultraviolette en optique ?

A
  • Optique en quartz et non en verre qui est opaque aux U.V.
  • Miroir à première surface (couche métallique non recouverte de verre)
  • Invisible pour l’œil humain, donc faut faire développer
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13
Q

Qu’est-ce que l’utilisation d’un faisceau d’électrons comme source d’éclairage améliore dans le microscope électronique à transmission (MET) ?

A

La limite de résolution.

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14
Q

Quelles sont les contraintes du microscope électronique à transmission (MET) ?

A
  • Faire le vide
  • Préparations très minces (0,5 μm)
  • Cellules mortes
  • Coût élevé
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15
Q

Quels sont les avantages du MET par rapport aux autres microscopes ?

A

Le MET permet une meilleure résolution et donc un grossissement efficace plus fort.

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16
Q

Quel est le processus de préparation des échantillons pour le MET ?

A

Les échantillons doivent être préparés très minces (0,5 μm) et peuvent être des cellules mortes.

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17
Q

Comment peut-on régler le problème de l’épaisseur des préparations en microscopie?

A

microtome et ultramicrotome

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18
Q

Quelle est la différence entre le microtome et l’ultramicrotome?

A

L’ultramicrotome coupe encore plus petit qu’un microtome.

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19
Q

Expliquez la préparation pour la coupe au microtome.

A
  • fixation: tuer les cellules dans le tissu
  • déshydratation: concentration croissante d’alcool (alcool remplace l’eau → intérieur devient hydrophobe)
  • intermédiaire: concentration croissante de toluène/xylène → enlever l’alcool et le remplace (+ hydrophobe que l’alcool)
  • inclusion: paraffine fondue (toluène remplacé par la paraffine)
  • spécimen incorporé dans la paraffine
  • microtome coupe et les coupes fusionnent avec la chaleur.
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20
Q

Expliquez la préparation pour la coupe au ultramicrotome.

A
  • fixation avec Glutaraldéhyde et Tétroxyde d’osmium: mort des cellules dans le tissu
  • déshydration avec concentration croissante alcool ou acétone.
  • intermédiaire: oxyde de propylène
  • incorporation du spécimen dans un vial dans l’epoxy
  • polymériser dans un four.
  • tailler et mis dans l’ultramicrotome
  • coupe avec du verre ou du diamant et tombe dans l’eau
  • utilisation d’un porte spécimen pour l’observation au microscope.
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21
Q

Qu’est-ce que le cryodécapage ?

A

Le cryodécapage est une technique qui utilise le froid pour durcir les échantillons biologiques avant de les couper en tranches minces pour l’observation au microscope électronique.

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22
Q

Expliquer la préparation du matériel pendant le cryodécapage.

A

1- congélation dans l’azote liquide
2- fracture grâce à une microhache
3- sublimation pour accentuer la fracture (décapage)
4- ombrage: mélange de platine et de carbone
5- réplique: part au microscope

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23
Q

Comment peut-on résoudre le problème du contraste en microscopie photonique?

A
  • Colorants usuels
  • Fluorochromes
  • Cytoenzymologie
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24
Q

Qu’est-ce que la technique de coloration en fluorescence primaire ?

A

technique de coloration où l’on utilise des substances qui fluorescent naturellement.

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25
Q

Qu’est-ce que la technique de coloration en fluorescence secondaire ?

A

technique de coloration où l’on utilise des substances qui doivent être colorées par les fluorochromes.

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26
Q

Qu’est-ce qu’un fluochrome?

A

Un fluorochrome est une substance chimique capable de fluorescer, c’est-à-dire d’émettre de la lumière à une longueur d’onde spécifique lorsqu’elle est exposée à une autre longueur d’onde de lumière.

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27
Q

Qu’est-ce que l’immunofluorescence ?

A

C’est une technique de coloration où l’on utilise des anticorps pour marquer des molécules spécifiques.

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28
Q

Expliquez un processus de l’immunofluorescence.

A
  • isoler les microtubules du cerveau de bovin
  • injection de tubulines purifiées et rappel dans un lapin (fait des anticorps contre la tubuline)
  • prise de sang
  • précipiter les anticorps ((NH₄)₂SO₄)
  • purifier les anticorps par affinité et ajouter des fluorochromes
  • traiter la cellule avec les anticorps fluorescents
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29
Q

Quel est le système additif des couleurs primaires ?

A

Le système additif des couleurs primaires est le rouge, le vert et le bleu.
* vert+rouge=jaune
* vert+blue=cyan
* bleu+rouge= magenta

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30
Q

Pour l’amélioration du contraste des préparations en photonique, quelles sont les approches pour les colorants usuels ?

A
  • Approche empirique: Technique que l’on juge strictement d’après le résultat
  • Histocytochimie: Technique où l’on se questionne sur les raisons de la coloration (ex. Pourquoi un colorant colore-t-il une organelle différemment d’une autre?)
31
Q

Expliquez la cytoenzymologie en photonique.

A

Substrat + Colorant –enzyme–> Produit 1 + Produit 2 (complexe coloré)

32
Q

Comment peut-on améliorer le contraste des préparations en microscopie électronique à transmission ?

A
  • imprégnation métallique,
  • coloration négative,
  • ombrage,
  • cytoenzymologie,
  • immunocytochimie - immunocytoenzymologie.
33
Q

Qu’est-ce que l’imprégnation métallique ?

A

dépôt de métaux lourds sur les membranes pour améliorer le contraste des préparations en microscopie électronique à transmission.

34
Q

Expliquez l’imprégnation métallique.

A
  • dépôt du tissus dans une solution de métaux lourds qui se déposent dans des endroits hydrophiles (membrane)
  • région sombre: endroit où les métaux lourds se déposent → électrons rebondissent, donc ne passe au travers les tissus et ne rejoignent pas le capteur.
  • région clair: endroit où les métaux lourds ne se déposent pas→ électrons passe au travers les tissus et rejoignent le capteur.
35
Q

Qu’est-ce que la coloration négative ?

A

coloration de l’environnement du spécimen tridimensionnel (besoin de relief)

36
Q

Expliquez la coloration négative.

A
  • Adsorption Virus (3D) sur la membrane.
  • déposer dans une solution avec métaux lourd qui se mettent sur la membrane
  • région claire: virus/spéciment
    *région sombre: membrane/environnement (électrons ne passent pas)
37
Q

Qu’est-ce que la technique de l’ombrage en microscopie électronique ?

A

La technique de l’ombrage en microscopie électronique consiste à créer une ombre sur des structures tridimensionnelles pour les rendre plus visibles sous le microscope électronique.

38
Q

Comment fonctionne la technique de l’ombrage en MET ?

A

C’est une technique qui permet de visualiser les structures en relief en projetant un faisceau d’électrons sur la préparation inclinée à différents angles.
Les parties les plus élevées apparaissent plus sombres et les parties les plus basses plus claires.

39
Q

Peut-on utiliser la technique de l’ombrage sur des coupes à l’ultramicrotome ?

A

Non

40
Q

Peut-on utiliser la technique de l’ombrage sur des préparations obtenues par cryodécapage ?

A

Oui

41
Q

Peut-on utiliser la technique de l’ombrage sur des virus ?

A

Oui

42
Q

Donnez un exemple de cytoenzymologie.

A

la réaction de Gomori

43
Q

À quoi sert la réaction de Gomori?

A

mise en évidence des lysosomes dans les cellules prcq la rxn se fait dans les lysosomes (dépot de métaux lourds dedans)

44
Q

Expliquer la réaction de Gomori.

A

(S) β-glycérophosphate + Colorant (+tampon nitrate de plomb) —-(E) Phosphate acide—-> (P1) Glycérol + (P2) Phosphate inorganique + nitrate de plomb ——> Phosphate de plomb (précipité dense aux électrons)

45
Q

Donnez des utilisations d’anticorps couplés.

A
  • Immunocytochimie
  • Immunocytoenzymologie
46
Q

Comment fonctionne l’immunocytochimie ?

A

L’immunocytochimie utilise des anticorps couplés à la ferritine (protéine dense aux électrons, protéine de stockage du Fer dans le foie)

47
Q

Comment fonctionne l’immunocytoenzymologie ?

A

L’immunocytoenzymologie utilise des anticorps couplés à des enzymes pour visualiser les antigènes spécifiques dans les cellules.

48
Q

Expliquez la réaction de l’immunocytoenzymologie.

A

DABH2 (diaminobenzidine réduite) ———————– > DAB (Diaminobenzidine oxydée) ———- > Ppt opaque aux électrons

H2O2 —–> H2O (rxn1)
Peroxydase-Ac-Ag (rxn1)
OsO4: Tétroxyde d’Osmium (rxn2)

49
Q

Quelle est la relation entre la rxn immunocytoenzymologie et l’amélioration du constate ?

A

plus la rxn se fait, plus y a accumulation ppt opaque, amplification du signal.

50
Q

Quelles sont les méthodes basées sur l’éclairage pour améliorer le contraste des préparations en photonique ?

A
  • Méthodes basées sur l’éclairage (permettent l’observation contrastée de cellules vivantes)
  • Autoradiographie
51
Q

Qu’est-ce que le microscope à champ sombre (fond noir) ?

A
  • la lumière vient d’en bas et un diaphragme annulaire fait en sorte que la lumière déviée passe dans l’objet.
  • donc, l’objet ressort en clair, et le champs est sombre.
52
Q

Donnez des exemples de contraste de phase.

A
  • Champ clair
  • Contraste de phase
  • Contraste interférentiel de Nomarski
53
Q

Qu’est-ce que l’anneau de phase ?

A

Un dispositif qui déphase la lumière de λ/4.

54
Q

Qu’est-ce que l’autoradiographie ?

A

C’est une technique d’imagerie qui utilise des isotopes radioactifs pour marquer des molécules biologiques.

55
Q

Quelles sont les alternatives à l’utilisation de l’autoradiographie en photonique et en MET ?

A

L’utilisation de films à rayons X ou d’un système d’imagerie des rayons bêta.

56
Q

Expliquez l’autoradiographie.

A
  • incubation des cellules avec isotope radioactif
  • lavage (retirer les trucs pas radioactif dans cellule)
  • fixation
  • déshydratation, paraffine, microtome
  • immersion dans une émulsion photographique liquide
  • développement en chambre noir
    (Les grains d’argent sur le film correspondent aux zones où l’échantillon radioactif a émis des rayons, permettant de visualiser et de quantifier la présence et la répartition des radio-isotopes dans l’échantillon.)
57
Q

Expliquez l’autographie d’une cellule traitée à l’uridine radioactive.

A
  • uridine présente dans ARN
  • donc, +grains d’Ag → +uridine radioactive → donne l’endroit de où se passe la transcription (nodule)
58
Q

Expliquez l’autographie d’une cellule traitée à la thymine radioactive.

A
  • thymine = ADN, donc montre ADN sous forme de chromosome
  • mise en contact avec thymine radioactive, rentre dans l’ADN, réplication, observation de chromosome avec thymine radioactive
59
Q

Qu’est-ce que le microscope électronique à balayage (MEB) ?

A

C’est un type de microscope électronique qui utilise un faisceau d’électrons qui balaye la surface du spécimen à observer
(meilleur pour les structures 3D)

60
Q

Expliquez le processus de la centrifugation différentielle en milieu homogène.

A
  • cellule broyée avec un broyeur de Potter (force de cisaillement entre broyeur et paroi)
  • homogénat que l’on met dans une éprouvette
  • 1er passage à la centrifugeuse: culot (noyau), surnageant (le reste des organelles plus petites)
  • 2e passage à la centrifugeuse: culot (mitchondrie, lysosomes, peroxysomes), surnageant
  • 3e passage à la centrifugeuse: culot (microsome rugueux), surnageant
  • 4e passage à la centrifugeuse: culot (membrane du réticulum endoplasmique et ribosomes), surnageant (détergent: sodium deoxycholate)
61
Q

Comment éviter la contamination par une autre organelle ?

A

faire un rincage

62
Q

Relation entre

A

les organelles/molécules les plus lourdes se retrouve dans le culot en premier. donc, il faut plus de g ou de temps pour la centrifugation d’organelles plus légère.

63
Q

Qu’est-ce que l’équation de Stokes ?

A

C’est une équation qui décrit le déplacement d’une particule sphérique dans un champ gravitationnel.

dx/dt= ((2r²(Dp-Dm))/9η)g
où
* r = rayon de la particule
* Dp = densité de la particule (masse volumique)
* Dm = densité du milieu de suspension (baignant la particule)
* η (êta) = viscosité du milieu de suspension
* g = force centrifuge exercée par la centrifugeuse

64
Q

Qu’est-ce que le coefficient de sédimentation «s» ?

A

Un coefficient qui regroupe les facteurs de l’équation de Stokes pour former une estimation grossière de la taille, de la forme et de la densité des particules biologiques présentes dans l’homogénat.

65
Q

Comment peut-on déduire le déplacement relatif des particules dans le cas de la séparation de diverses classes de particules ou d’organelles du même milieu de suspension ?

A

Dans le cas de la séparation de diverses classes de particules ou d’organelles du même milieu de suspension, le déplacement relatif des particules dépend de leur densité et de leur taille.

66
Q

Que se passe-t-il lorsqu’une particule migre dans le tube à centrifugation ?

A

Lorsqu’une particule migre dans le tube à centrifugation, cela signifie que sa densité est plus élevée que celle du milieu.

67
Q

Quelle est l’unité de mesure utilisée pour la valeur “s” et sa valeur ?

A

L’unité Svedberg (S).
1E13 seconde

68
Q

Qu’est-ce que la centrifugation zonale ?

A

Une centrifugation basée sur l’équation de Stokes, mais où l’homogénat est déposé en surface d’un léger gradient de saccharose.

69
Q

Quelle est la relation entre la valeur de “s” et la vitesse de sédimentation de la particule ?

A

Plus la valeur de “s” est élevée, plus rapidement la particule sédimente au fond du tube.

70
Q

Quels sont les deux types de gradient utilisés dans la centrifugation en gradient de densité ?

A
  • gradient discontinu
  • gradient continu.
71
Q

Quelle est la différence entre la centrifugation zonale et la centrifugation en gradient de densité ?

A

La centrifugation en gradient de densité est basée uniquement sur la densité, tandis que la centrifugation zonale est basée sur la taille et la forme des particules.

72
Q

Expliquez la préparation d’une centrifugation zonale.

A
  • gradient de densité créé dans tube de centrifugation avec solution de saccharose pour que densité augmente du haut vers bas du tube. - Pendant centrifugation, particules migrent à travers le gradient à des vitesses qui dépendent de leur taille, forme et densité.
  • Particules ne se déplacent pas jusqu’au fond du tube mais sont séparées en “zones” au sein du gradient. Par0cules s’arrêtent dans gradient là où leur densité est égale à celle du gradient. Chaque bande peut être collectée séparément pour l’analyse.
73
Q

Expliquez le gradient continu.

A
  • Utile pour séparer particules proches en densité. Formé par solution dont densité augmente de manière progressive et homogène de haut en bas, sans transitions brusques.
  • Pour préparer, mélanger graduellement deux solutions de différentes densités pour obtenir transition douce. Lors de centrifugation, particules se déplacent à travers gradient jusqu’à atteinte de région où leur densité est égale à celle de solution environnante, ce qui permet séparation en fonction de densité.
  • différence minime de densité entre les “couches”
74
Q

Expliquez le gradient discontinu.

A
  • Utile pour séparer particules dont différence de densité plus grande. Constitué de couches distinctes de solutions ayant différentes densités. Chaque couche forme phase distincte
  • Pour préparer, pipeter volumes de solutions de différentes densités dans tube de centrifugation, créant des strates visibles.
  • Solutions plus denses placées au fond et moins denses ajoutées au- dessus. Lors de sédimentation, particules traversent couches jusqu’à atteinte de couche dont densité supérieure à la leur.

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