cours 2 Flashcards
qu’est- ce qui permet une influence du pH sur kcat/km ?
l’ionisation des groupes sur l’enzyme libre et sur le substrat
quelles sont les causes de l’influence du pH sur le kcat ou le km ?
l’ionisation du substrat, de l’enzyme libre, du complexe ES ou de l’acyl enzyme et, en conséquence, peut dépendre du substrat utilisé
quand l’étude de l’influence du pH sur l’activité de l’enzyme est valable ?
seulement dans un intervalle de pH où l’enzyme est stable
où les protéases à cystéines sont-elles présente ?
dans une grande variété d’organismes
(Bactéries, virus, parasites, plantes, mammifères)
quels sont les types de protéases à cystéines ?
- cathepsines
- caspases
- calpaïnes
- USP (protéases spécifique de l’ubiquitine)
c’est quoi les calapaïnes ?
des protéases à cystéine dépendantes du calcium
c’est quoi les caspases ?
des protéases qui coupent après un résidu aspartate.
impliquées dans:
- plusieurs processus cellulaires (apoptose, prolifération et différentiation)
- certaines conditions pathologiques (cancer et inflammation)
où peut-on retrouver la diversité chez les cathepsines ?
au niveau de
- la distribution dans les tissus
- rôles physiologiques et pathologiques
- la spécificité du substrat
- des aspects structuraux de l’enzyme mature et de son précurseur
quels sont les conséquences du nombre grandissant des protéases à cystéines ?
- possibilité de redondance fonctionnelle
- plus difficile d’attribuer le rôle physiologique/pathologique d’une enzyme donnée
- plus difficile de faire l’ingénierie d’inhibiteurs spécifiques
quels sont les cathepsines impliqués dans la dégradation des protéines ?
B
C
H
L
quels sont les cathepsines impliqués dans la préparation d’antigènes ?
B
L
H
quels sont les cathepsines impliqués dans la dégradation des chaînes légères d’Ac ?
S
L
(V,F)
quels sont les cathepsines impliqués dans la régulation (activation des pro-enzymes) ?
C
quels sont les cathepsines impliqués dans la résorption osseuse (dégradation de la matrice de collagène de l’os) ?
K
quels sont les cathepsines reliées aux maladies osseuses (ostéoporose) ?
K
quels sont les cathepsines reliées à la formation de métastase ?
B
L
quels sont les cathepsines reliées à l’arthrite rheumatoïdes (dégradation du cartilage articulaire) ?
B
K
quels sont les cathepsines reliées aux emphysèmes ?
C
S
K
quels sont les cathepsines reliées aux maladies du système immunitaire (asthme, rejet de transplantation) ?
C
S
L, (V)
quels sont les cathepsines reliées aux maladies génétiques ?
K
C
B
quels sont les cathepsines reliées à la pycnodysostose ?
K
quels sont les cathepsines reliées au syndrôme Papillon-Lefèvre ?
C
quels sont les cathepsines reliées à l’épilepsie progressive ?
cystatine B
quel est l’inhibiteur de la cathepsine ?
cystatine B
quel est l’enzyme typique de la classe des protéases à cystéines ?
la papaïne
de quoi est formée la papaïne ?
d’une seule chaîne polypeptidique de 212 acides aminés et contient 3 ponts disulfure
que suggère l’homologie de séquences des protéases à cystéine provenant de différentes sources ?
que ces enzymes possèdent des structures tridimensionnelles similaires
par qui les protéases à cystéines sont inactivées sélectivement ?
par le E-64 (un inhibiteur de source microbienne (isolé de cultures de Aspergillus japonicus))
par qui les protéases à cystéines sont inhibées ?
par l’iodoacétate
dans le mécanisme des protéases à cystéines, par qui le groupement nucléophile est fourni ?
par une Cys au lieu de Ser
quels sont les étapes du mécanisme des protéases à cystéines ?
- anion thiolate attaque C du C=O et production de l’intermédiaire tétraédrique
- lente transformation de l’intermédiaire tétraédrique en intermédiaire acyle-enzyme, grâce à l’His159 qui joue le rôle d’acide
- hydrolyse rapide de l’intermédiaire acyl-enzyme pour donner P2 et régénérer la forme active de l’enzyme.
quelle est l’étape limitante du mécanisme des protéases à cystéines ?
formation de l’intermédiaire acyl-enzyme
quels sont les composantes de la triade catalytique de la protéase à cystéine ?
1.Asparagine 75
2. Histidine 159
3. Cystéine 25
quels sont les composantes de la triade catalytique de la protéase à sérine ?
- Aspartate 102
- Histidine 57
- Serine 195
quand l’activité enzymatique est maximale dans le profile pH-activité de la papaïne ?
- lorsque Cys25 est sous forme d’anion thiolate (RS-)
- lorsque His59 est sous forme de cation imidazolium (ImH+)
comment stabiliser l’intermédiaire instable formé dans le mécanisme d’hydrolyse de peptides par les protéases à cystéine ?
à l’aide de groupements dans la cavité oxyanionique stabiliseront l’intermédiaire en formant des ponts H et vont alors accroître la catalyse
la chaîne latérale de quelle acide aminé est impliqué dans la cavité oxyanionique de la papaïne ?
glutamine 19
qu’est ce qui constitue une preuve directe du rôle mécanistique de la cavité oxyanionique dans la stabilisation de l’état de transition ?
changements d’énergie libre (ΔΔG) et la diminution de kcat/km causé par les mutations Gln19Ala et Gln19Ser
sous quelle condition se font l’hydrolyse des thioimidates en solution ?
à pH acide
quelle est la forme du thioimidate au site actif de la papaïne selon les études ?
sous une forme non-protonée
que permet l’introduction d’un donneur de proton dans la cavité oxyanionique ?
de favoriser la protonation du thioimidate, le rendant plus réactif, ce qui facilite la catalyse enzymatique des cystéine protéases
nomme-moi un un mutant avec un donneur de proton dans la cavité oxyanionique ?
Gln19Glu
quelle activité possède le mutant Gln19Glu ?
l’activité nitrile hydrase
quelle est la spécificité en P2 de la papaïne ?
la Phe. Elle hydrolyse de façon efficace un substrat possédant une phénylalanine en P2
quelle est la spécificité en P2 de la cathepsine B ?
Bien qu’elle hydrolyse de préférence un substrat avec une Phe en P2, elle peut aussi hydrolyser de façon efficace un substrat possédant une arginine en P2
qu’est-ce qui a été employée pour changer la spécificité de la papaïne pour lui donner la spécificité de la cathepsine B ?
la mutagenèse dirigée
à partir de l’alignement des séquences (papaïne et cathepsine B) et de la structure tertiaire (papaïne), des mutants de la papaïne ont été produits. quelles sont-ils ?
1) le double mutant Val133Ala / Ser205Glu
2) le triple mutant Val133Ala / Val157Gly / Ser205Glu
Le « changement » de spécificité de la papaïne pour lui donner la spécificité de la cathepsine B est obtenu avec quelle mutant ?
avec le double mutant
Val133Ala / Ser205Glu
quelle activité possède la capthesine B ?
une activité carboxypeptidase dipeptidique
à quoi l’activité carboxypeptidase dipeptidique, qu’on ne rencontre pas chez la papaïne ni chez les cathepsines L, S et H, a été attribuée ?
à la structure particulière de cette enzyme
quel lieu occupe la boucle d’insertion ?
les sous-sites S’ de l’enzyme
que contient la boucle d’insertion ?
2 résidus His dans une position où ils peuvent interagir avec le groupement carboxylate du résidu P2’ à l’extrémité C-terminale d’un substrat
quelles sont les différences structurales entre la cathepsine B et la papaïne ?
papaïne: endopeptidase
cathepsine B: carboxypeptidase dipeptidique
présence d’une boucle d’insertion
quels sont les nomenclatures des substrats ?
(1) substrat artificiel carboxypeptidase;
(2) substrat endopeptidase étendu (ENDO);
(3) substrat carboxypeptidase dipeptidique
(EXO).
quelle est l’influence de la boucle d’occlusion sur l’activité de la cathepsine B envers différents substrats ?
avec boucle d’occlusion (non-mutée)
- majoritairement une activité exopeptidase
sans la boucle d’occlusion:
- perte d’activité exopeptidase
- augmentation de l’activité endopeptidase
Sa suppression (boucle d’occlusion) (mutation His110Ala / Asp22Ala) transforme l’enzyme en endopeptidase
quels sont les 2 sous-sites importants pour l’activité protéase de la cathepsine B ?
Sous-site S2: responsable pour la spécificité pour une Phe en P2 (suffisant pour une activité endopeptidase)
Sous-site S2’: responsable de la spécificité positionnelle (explique l’activité exopeptidase)
résumé:
S2 → Coupe à l’intérieur des protéines
S2’ → Coupe les extrémités des protéines
certaines cathepsines (les exopeptidases) ont d’autres caractéristiques structurales spécifiques que les cathepsines (non exopeptidase). quels sont-ils ?
une obstruction de la cavité de liaison du substrat qui est un déterminant important de la spécificité
explication: pour limiter l’accès à l’intérieur de la cavité catalytique, ces enzymes possèdent souvent des structures obstruant partiellement le site actif, empêchant ainsi la fixation de longs peptides.
quelles sont les protéases à zinc ?
- protéases bactériennes
- protéases et peptidases de mammifères
quelles sont les protéases bactériennes ?
thermolysine
protéase neutre de B. subtilis
Aminopeptidase N de E. coli
quelles sont les protéases et peptidases de mammifères ?
Carboxypeptidases A et B (digestion)
Aminopeptidase
Endopeptidase neutre
Métalloendopeptidase
quelle est la fonction de la thermolyse ?
elle coupe les liens peptidique en N-terminale d’un résidu hydrophobe
quelle est la fonction des ollagénases et stromélysine ?
dégrader de la matrice extracellulaire
quelle est la fonction de l’endopeptidase neutre ?
couper les liaisons peptidiques en N- terminal d’un résidu hydrophobe
quelle est la fonction du métalloendopeptidase ?
couper les liaisons peptidiques en C terminal d’un résidu hydrophobe
le Zn au site actif est complexé à quoi ?
à de2ux histidines, à 1 acide glutamique ainsi qu’à 1 molécule d’eau.
Un autre acide glutamique intervient dans la réaction qui n’est pas complexé au zinc.
quelle type de peptidases est la carboxypeptidase A ?
une exopeptidase
quelle réaction est catalysée par la carboxypeptidase A ?
l’hydrolyse du lien peptidique au C-terminal.
L’hydrolyse est accélérée lorsque l’acide aminé en C-terminal a une chaîne latérale aromatique ou hydrophobe.
dans le mécanisme d’action de la carboxypeptidase A, le groupe carboxyle C-terminal chargé négativement interagit avec qui ?
avec une arginine (Arg145) chargée positivement
dans le mécanisme d’action de la carboxypeptidase A, la chaîne latérale de la tyrosine du substrat est placée où ?
dans une cavité non-polaire au sous-site S1’ de l’enzyme
dans le mécanisme d’action de la carboxypeptidase A, le Zn est coordonné à quoi ?
à trois ligands sur l’enzyme : His69, His196 et Glu72
ainsi qu’à O du C=O en position P1 du substrat
dans le mécanisme d’action de la carboxypeptidase A, quel type de catalyse a lieu ?
catalyse générale acide-base
quels sont les caractéristiques communes aux mécanismes des protéases ?
1) groupement nucléophile qui peut réagir avec le C=O du substrat
2) un acide ou une base pour la catalyse générale acide ou basique
3) des donneurs de ponts H ou une espèce chargée + pour stabiliser l’intermédiaire tétraédrique formé durant la réaction
quel est l’état intermédiaire dans la catalyse enzymatique des cystéine protéases, comme la cathepsine B ?
le thioimidate
