Cours 1 Flashcards
Qu’est-ce que le principe de protéines recombinantes?
L’ADN à cloner est insérer dans le plasmide, ce qui crée le plasmide recombinant. Ensuite, transformation bactérienne pour voir les cellules se transformées en bactérie en présence d’antiobiotique. Il y a multiplication cellulaire et ça donne plusieurs bactéries recombinantes produisant la protéine d’intérêt ou le métaboline d’intérêt.
Qu’est-ce que la biotechnologie?
Application de la science et de la technologie à la création et à l’utilisation de nouveaux organismes vivants pour la production de savoir, de biens, et services.
Basée sur la modification génétique d’autres organismes déjà considérés comme utiles à l’homme.
Plusieurs disciplines possibles.
Important dans la vie de tous les jours
Nommez quelques exemples de biotechnologie
- Nouveaux vaccins
- Réparation d’organes et tissus endommagés
- Augmenter les rendements agricoles
- Traitements pour l’infertilité
- Biocombustibles écologiques
Pourquoi la biotechnologie est si importante?
Croissance de la population
Quel est le premier produit de la biotechnologie moderne? Et à quoi ça sert?
L’hormone insuline.
Permet le stockage du glucose et permet de traité le diabète.
Quelles sont les principales protéines thérapeutiques (7)?
-Anticorps monoclonaux
-Hormones peptidiques
-Facteurs de croissance
-Cytokines
-Enzymes
-Anticoagulants
-Vaccins recombinants
Qu’est-ce qu’une bioraffinerie?
La bioraffinerie utilise des biocarburants et des bimatériaux comme des bioplastiques. Les composés utilisés sont bio-dégradables, biomasse renouvelable et comporte des enzymes (OGM).
Qu’est-ce que la bioremédiation/biorestauration?
Contrôler des communaités bactériennes pour nettoyer à l’échelle moléculaire. A pour but l’assainissement des sols, eaux, épuration des gaz résiduels, recyclage des déchets, etc.
Quelle technique est à la base de la biotechnologie moderne?
PCR
Vrai ou faux
Le clonage par assemblage est bidirectionnel?
Faux, le clonage est unidirectionnel
Pourquoi ne pas utiliser le clonage traditionnel?
Cette technique est très longue
1) PCR 90 min
2)Enzyme de restriction 60 min
3) Déphosphorylation 30 min
4) Purification 75 min
5) Ligation 30 min
Transfo et identification
Pourquoi faire une réaction d’assemblage?
1) Pas besoin de digestion
2) 1 mastermix de 3 enzymes
3) 1 seul tube
4) Clonage unidirectionnel
5) 15-60 minutes
Quelles sont les différences entre une mutagénèse aléatoire et une mutagénèse dirigée?
Mutation effectuée à un site particulier sur l’ADN et connaissance de la séquence pour une mutagénèse dirigée versus pas de connaissance requise de la séquence et basé sur l’exposition à des agents chimiques.
Pourquoi faire une mutagénèse dirigée?
1) Optimisation des codons
2) Optimisation des paramètres cinétiques
3) Augmenter la tolérance thermique
4) Augmenter la tolérance thermique
5) Empêcher la régulation allostérique
6) Éliminer le besoin en cofacteur
7) Faciliter la purification
À quoi sert les amorces?
Outils moléculaires pour faire de la mutagénèse dirigée
Qu’est-ce qu’un produti de PCR?
Région comprise entre les 2 amorces et comprend les amorces.
Vrai ou Faux
Plus le nombre de réactions de PCR est élevés, plus les risques d’introduction de mutations secondaires est élevé?
Vrai
Comment faire une amorce?
1) choisir un codon qui demande le moins de changement de nucléotides
2) chaque amorce devrait avoir une longueur d’environ 25-35 nt
3) Le mismatch devrait être localisé au centre
4) chaque amorce devrait posséder un G ou C en 3’
5) les sites de restrictions doivent être protégés en ajoutant des bases aux extrémités
Vrai ou Faux
Il est nécessaire d’avoir un brin complémentaire pour amplifier?
Vrai
Quelle est la fonction principale de l’extension sur un vecteur Quickchange?
Processus rapide et seul les brins parentaux sont amplifiés. Peu de chance d’introduire des mutations secondaires.
Pourquoi faire des plasmides mutants?
En transformant, les plasmides sont réparés dans la bactérie parce que les extrémités 5’ sont phosphorylés.
Quels sont les avantages d’un diagnostic moléculaire?
-Sensibilité
-Spécificité
-Simplicité
-Rapidité
-Pas infaillibles par contre
Quelles sont les techniques isothermes de détection d’ARN ou d’ADN sans amplification?
- Fluorescence in situ hybridization (FISH)
-Détection de micro-organismes avec des balises moléculaires (Fluorimètre)
Quelles sont les techniques isothermes de détection d’ADN ou d’ARN avec amplification?
- Avec amplification du signal
- Amplification de la cible par transcription
- Amplification de la sonde
Comment mettre en évidence des mutations ponctuelles ou de délétions dans une séquence connue?
- Mutations abolissant ou créant un site de restriction
- Test Amplification Refractory Mutation System (ARMS)
- PCR pour la détection de délétions ou d’insertions
À quoi sert les puces à ADN pour le diagnostic moléculaire?
Pour mettre en évidence un problème d’expression génique
Quels sont les concepts importants dans la production de protéines recombinantes?
- Gène d’intérêt
- Vecteur d’expression
- Transfection dans une cellule hôte
- Protéine exprimée
- Protéine purifiée
Comment choisir le système d’expression?
Caractéristiques de la protéine :
- Ponts disulfures et modifications post-trad
Applications :
- Structure, essais fonctionnels, protéine thérapeutique, antigène
-Rendement
- Coût de production
Quelles sont les stratégies de purification?
Charge, pI : Chromatographie échangeuse d’ions
Masse moléculaire : Tamis moléculaire = gel de filtration
Affinité : Chromatographie = plus utilisé
Hydrophobicité/polarité : Chromatographie hydrophobe et phase inverse
Vrai ou Faux
Chez l’expression des procaryotes, le promoteur est dans la région en 5’ du CDS ce qui permet la liason de l’ARN Pol qui initie la transcription?
Vrai
Quels sont les éléments importants pour la traduction chez les procaryotes?
Ribosome binding site
Codon d’initiation
Codon stop
Quelle est une des différence entre l’expression chez les eucrayotes et procaryotes?
Les protéines eucaryotes produites chez les procaryotes peuvent être inactives : Absence de modification post-traductionnelles (ponts disulfure et glycosylation) Contenir des contaminants bactériens non acceptables pour une utilisation thérapeutique ou alimentaire
Qu’est-ce que le principe du système T-Rex?
1) Liguer le gène d’intérêt dans le vecteur d’expression
2) Cotransfecter le vecteur d’expression inductible et le vecteur répresseur de tétracycline dans les cellules.
3) Ajouter la tétracycline pour déréprimer le promoteur hybride et induire l’expression du gène d’intérêt
4) Purification de la protéine d’intérêt
Qu’est-ce que l’expression transitoire?
L’ADN ne s’intègre pas dans le génome, l’expression dure 12-72h mais avec un fort niveau d’expression.
Qu’est-ce qu’une expression stable?
Intégration du vecteur dans le génome : l’ADN s’intègre dans le génome et il confère un nouveau trait génétique
Expression à très long terme
Très avantageux dans le cas de production d’une protéine recombinante
Étape 1 : Création ou achat de lignée cellulaire eucaryote Flp-In dans laquelle on a inséré un site FRT dans le génome.
Étape 2 : Création d’une ligné cellulaire Flp-In recombinante qui contient le gène d’intérêt inséré dans son génome, dans le site FRT.
Est-ce une expression stable constitutive ou inductible?
Expression stable constitutive
Étape 1 : Création ou achat de lignée cellulaire eucaryote Flp-In T-Rex dans laquelle on a inséré un site FRT dans le génome et le gène codant pour TetR.
Étape 2 : Création d’une ligné cellulaire Flp-In T-Rex recombinante qui contient le gène d’intérêt inséré dans son génome, dans le site FRT.
Est-ce une expression stable constitutive ou inductible?
Expression stable inductible
Quelles sont les méthodes de transferts de gènes dans les cellules eucaryotes?
- Molécules transporteuses chargées positivement
- Physique : Électroporation, Gene Gun, Micro-injection
- Virale : Adénovirus, Lentivirus, Rétrovirus
Quelles sont les différences entre les petites molécules et les médicaments biologiques?
- Synthèse chimique pour les petites versus l’issue biotechnologie moderne
- La grosseur plus petite que 10 kda pour les petites molécules
- Administration orale par pilule pour les petites versus par intraveineuse pour les médicaments biologiques pour éviter de passer par le syst.digestif
- Petites molécules pas de problème d’immunogénicité versus médocs biologiques
Quelles sont les contraintes des protéines thérapeutiques?
- Protéolysées par le syst.gastro-intest
- Administrée par injection
- injection fréquente
- Doit améliorer la stabilité et ciblage
À quoi servent les protéines thérapeutiques avec une activité enzymatique?
1) Remplacer une protéine inactive
2) Augmenter une voie métabolique
3) Apporter une nouvelle fonction
-dégradation enzymatique
-muscoviscidose
-augmenter la perméabilité
À quoi servent les anticorps monoclonaux?
1) Interférer avec une molécule ou un micro-organisme
2) RadioImmunothérapie
Qu’est-ce qu’un OGM?
Organisme dont on a modifié le génome pour lui conférer de nouvelles propriétés.
Nommez quelques application des OGMs?
Plantes résistantes aux herbicides
Plantes résistantes au stress
Plantes à valeur nutritive améliorée
Ralentir le mûrissement et le brunissement
Croissance accélérée
Pourquoi développer des plantes génétiquement modifiées?
Amélioration de la productivité par unité de surface agricole
Simplifier le travail au champ
Augmentation de la résistance à la sécheresse
Comment produire des plantes génétiquement modifiées?
Développer de nouveaux vecteurs avec le plasmide Ti, soit par vecteur binaire ou co-intégratif
Quelles sont les différents types e transgénèse?
Stratégie de l’ARN antisens
Stratégie du nouveau gène
Stratégie du gène régulateur
