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Engenharia Genética > Clonagem de Genes > Flashcards

Clonagem de Genes Flashcards

1
Q

Define nucleases

A

Cortam, encurtam ou degradam moléculas de
ácidos nucleicos (DNA) ao quebrarem as ligações de fosfodiéster entre os nucleótidos
de uma cadeia de DNA.

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2
Q

Define Ligases

A

Juntam moléculas de
ácidos nucleicos.

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3
Q

Define Polimerases

A

Fazem cópias de
moléculas.

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4
Q

Define enzimas modificadoras

A

Removem ou adicionam
grupos químicos.

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5
Q

Quais os tipos de nucleases existem?

A

Exonucleases-Removem nucleótidos, um a um, a partir do final da molécula de DNA.
Endonucleases: Quebram as ligações fosfodiéster internas do DNA.

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6
Q

Descreve todas as funções das ligases.

A

1) Reparação de intervalos na cadeia simples
(“descontinuidades”)
2) São capazes de juntar fragmentos individuais da cadeia dupla de DNA.

Têm um papel essencial na construção de moléculas de DNA recombinante.

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7
Q

Descreve sucintamente como funcionam as polimerases.

A

Sintetizam uma nova cadeia de DNA complementar através de uma cadeia molde de DNA ou RNA. É necessário um primer para a iniciação da polimerização.

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8
Q

Quais os 4 tipos de DNA polimerases que são usados na engenharia genética?

A

DNA polimerase I, Fragmento de Kleanow, TAQ Polimerase, Transcriptase Reversa

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9
Q

DNA polimerase I

A

Preparada a partir de E. coli.
Sintetiza e Degrada.

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10
Q

Fragmento de Kleanow

A

Consiste numa DNA polimerase I modificada, cuja atividade de nuclease foi removida. A enzima sintetiza uma cadeia de DNA complementar a uma cadeia simples molde, mas não consegue continuar a síntese uma vez preenchido o nick. (não é capaz de degradar a cadeia)

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11
Q

TAQ Polimerase

A

Utilizada nos programas de PCR . As suas enzimas são termoestáveis.(resistência à desnaturação por altas temperaturas) Sintetizam e não degradam

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12
Q

Transcriptase Reversa

A

Envolvida na replicação de vários tipos de vírus.
Utiliza como cadeia molde o RNA e não DNA. Por isso, é essencial na técnica de clonagem de DNA complementar (cDNA).

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13
Q

Função das enzimas modificadoras de DNA

A

Atuam nos terminais da molécula de DNA e modificam-na através da adição ou remoção de grupos químicos específicos.

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14
Q

Exemplos de enzimas modificadoras de DNA

A

Fosfatase Alcalina - Remove o grupo fosfato
Quinase Polinucleótida . Adiciona o grupo fosfato
Transferase terminal Desoxinucleótidica - Adiciona um ou mais desoxirribonucleótidos no terminal 3’ da
molécula de DNA

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15
Q

O que são as endonucleases de restrição ?

A

Cortam o DNA em sequências nucleotídicas específicas (sequência de reconhecimento).

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16
Q

Tipos de corte produzido pela endonuclease de restrição:

A

Blunt ends : Corte simples de cadeia dupla no meio de uma sequência de reconhecimento
Sticky end: Clivagem é escalonada, normalmente por 2 ou 4 nucleótidos

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17
Q

Como construir um mapa de restrição?

A

1) Determinar o nº de fragmentos e o seu tamanho através de uma eletroforese em gel
2) Várias ingestões duplas
3) Comparação dos resultados de digestão simples e duplas
4) Mapeamento dos locais de restrição

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18
Q

Qual o tipo de corte da molécula que mais beneficia o trabalho das ligases?

A

A ligação de sticky ends complementares é muito mais
eficiente – podem ligar-se por complementaridade
de bases por pontes de hidrogénio, originando uma estrutura estável para a enzima trabalhar

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19
Q

Como colocar sticky ends numa molécula com blunt-ends?

A

Utiliza-se um fragmento de Kleanow para preencher os cortes e depois uma DNA ligase para sintetizar as ligações fosfodiéster finais

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20
Q

Objetivo do PCR :

A

Amplificação seletiva de uma região de interesse da molécula de DNA.

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21
Q

Fases da técnica de PCR:

A

1) Desnaturação : Quebra das pontes de hidrogénio (94 ºC)
2) Hibridação
3) Ligação dos primers à molécula
4) Síntese: A TAQ polimerase liga-se a um terminal do primer e sintetiza a nova cadeia complementar (74 º C)
5) Desnaturação das moléculas que contém cadeia original e a nova
6) Começa o 2º ciclo
(…)
Continuar o ciclo até um dos produtos da reação esgotar

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22
Q

Características do primer :

A

1) Comprimento entre 17 e 28 bp
2) C ou G % entre 50 e 60 %
3) Sequência deve terminar em G ou C ou em (CG u GC)

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23
Q

Temperatura de hibridação :

A

1) Baixa o suficiente para permitir a hibridação entre o primer e a cadeia molde
2) Elevada o suficiente para prevenir a formação de híbridos incompatíveis

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24
Q

Características necessárias para ser um vetor de clonagem:

A

1) Replicar dentro da célula hospedeira
2) Ser pequeno
3) Fácil de purificar
4) Elevada eficiência de transformação
5) Marcadores seletivos convenientes para transformantes e recombinantes;
6) Capacidade de clonar peças razoavelmente grandes de DNA

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25
Q

Plasmídeo:

A

1) Molécula de DNA circular
2) Tem resistência a antibióticos

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26
Q

Bacteríofagos:

A

Vírus que afeta bactérias.
Estrutura simples que consiste numa molécula de material genético rodeado por uma cápsula.

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27
Q

Quais os dois tipos de bacteriófagos existentens?

A

Podem ser dois tipos:
Cabeça e cauda - exemplo: Fago λ
Filamentoso - Fago M13

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28
Q

Descrição dos 4 passos do ciclo de infeção de um fago:

A

1) O fago entra na bactéria e injeta o seu DNA
2) As moléculas de DNA do fago replicam-se
3) Os componentes da cápsula são sintetizados e geram se as novas partículas dos fagos ( nos fagos λ esta etapa não acontece)
4) Lise celular ( não acontece no M13)

29
Q

Ciclo Lítico

A

Há replicação do DNA do fago de seguida a síntese de proteínas do capsídeo, a célula lisa e novos fagos são libertados para o meio.

30
Q

Ciclo Lisogénico

A

O DNA do fago é inserido no genoma bacteriano.
A forma integrada do DNA do fago designa-se por profago e há lise celular. Fago gama

31
Q

Características do fago M13:

A

O DNA do M13 não se integra no genoma bacteriano e com estes fagos nunca ocorre lise celular.

32
Q

O que são os cos sites?

A

São os sticky ends λ.

33
Q

Qual o papel dos sticky ends?

A

Permitem circularizar ( pré-requisito necessário para a inserção da mesma no genoma bacteriano)

34
Q

Quais os vetores de clonagem que podem ser utilizados com E. Coli ?

A

Plasmídeo, Bacteriófago λ e M13.

35
Q

Vantagem do pBR322:

A

Só as celúlas com pBR322 são capazes de formar colónias num meio de cultura agarizado com ampicilina e tetraciclina. ( o plasmideo é resistente a estes antibióticos)

36
Q

Vantagem do pUC8:

A

Permite indentificar a existência de células com ampicilina e lac-Z.

37
Q

O que são os Cosmídeos ?

A

Vetores de clonagem baseados no bacteríofago λ. São hibridos entre uma molécula de DNA de um fago e um plasmideo bacteriano.

38
Q

Cosmídeo=

A

Plasmídeo + cos sites

39
Q

Etapas da clonagem com um cosmídeo:

A

1) Abre-se o cosmídeo no seu único local de restrição e inserem-se os novos fragmentos de DNA.
2) Ocorre a ligação do novo DNA e a formação das “catenanes” .
3) Clivagem dos cos sites e colocação dos cosmídeos recombinantes em partículas de fago maduras.
4) Os fagos λ são depois utilizados para infetar a cultura de E. coli. Pelo contrário, as células infetadas são plaqueadas num meio seletivo e as colónias resistentes ao antibiótico crescem.

40
Q

Vetor para leveduras

A

Plasmídeo 2 μm

41
Q

YEps:

A

Plasmídeos epissomais de
leveduras - derivados do plasmideo 2 μm

42
Q

Gibson assembly:

A
  1. Amplificação das regiões genómicas por PCR com os primers adequados que sejam sobreponíveis no vetor e no fragmento
  2. Linearizar o vetor com uma enzima de restrição
  3. Adição da exonuclease (5’-3’) para degradar o terminal 5’ do vetor e do fragmento
  4. O vetor e o fragmento alinham
  5. Adição da DNA polimerase para sintetizar as porções de cadeia dupla em falta prolongando as extremidades
  6. Adição da DNA ligase para realizar a ligação fosfodiéster
  7. Eletrotransformação de E.coli
  8. Seleção: meio LB + (marca de seleção do vetor de clonagem)
  9. Extração do DNA e sequenciação para confirmar a presença do material genético de interesse
43
Q

Quais são os dois propósitos da clonagem em células de DNA vivas ?

A
  1. Grande número de moléculas recombinantes produzidas
  2. Purificação - seleção da molécula recombinante desejada numa mistura
44
Q

Dois tipos de transformação em células vivas:

A

Naturalmente ou Competentes induzidas/artificiais

45
Q

Eletrotransformação/Eletroporação:

A

As bactérias são submetidas a um pulso elétrico, induzindo a captação de DNA.
Os poros permitem a entrada de DNA nas
células. Quando a parede celular é reconstruída, o DNA fica preso no interior.

46
Q

Fatores que afetam a eficiência da eletroporação:

A

1) Temperatura;
2) Parâmetros de campo elétrico (voltagem, resistência, etc.);
3) Forma topológica do DNA;
4) Fatores da célula hospedeira (historial genético, condições de crescimento)

47
Q

Funções dos cos sites:

A

1) Permitir que a molécula de DNA linear seja circularizada (condição necessária para inserção no genoma bacteriano)
2) Produz-se um elevado nº de moléculas de DNA

48
Q

Funções dos cos sites:

A

1) Permitir que a molécula de DNA linear seja circularizada (condição necessária para inserção no genoma bacteriano)
2) Produz-se um elevado nº de moléculas de DNA λ

49
Q

Etapas da introdução de DNA em células vivas:

A

1) Criar uma molécula de DNA recombinante
2) Introduzir essa molécula em células vivas
3)Crescer e dividir para produzir clones

50
Q

Em que consiste uma molécula de DNA recombinante?

A

Um fragmento de DNA e um vetor ( molécula de DNA circular)

51
Q

Fases do procedimento da eletrotransformação:

A

1) Centrifugação
2) Ressuspensão em água estéril
2) Resfriar a mistura no gelo+ centrifugação e ressuspensão
3) Células competentes devem ser usadas imediatamente misturadas com a molécula de DNA recombinante e exposta ao eletrochoque correto
4) Coloca-se a mistura num tampão salino
5) Eletrotransformantes são isolados por plaqueamento em meio seletivo LB

52
Q

Genes Tra

A

Responsável pela formação dos pilli, permitindo a conexão entre a célula doadora (F +) e a célula recetora (F-)

53
Q

Genes Mob

A

Responsável pela mobilidade do plasmídeo. Quando as células são tra- mob+, diz-se que são mobilizáveis. Não são capazes de transferir o genoma para a célula recetora.

54
Q

Acasalamento triparental

A

1) Células muito próximas
2) Plasmideo conjugativo mobilizável
3) Autotransfere-se da célula auxiliar (tra+,mob+)
4) Célula dadora(tra-,mob-) com vetor de clonagem de plasmideo mobilizável
4) Vetor de clonagem do plasmideo é transferido para a célula recetora-alvo
5) Esta célula é capaz de crescer em meio minimo

55
Q

Introdução de DNA em células não bacterianas

A

1) A levedura cresce até à fase intermédia;
2) Tratar as células com solução de acetato de lítio para comprometer a parede celular;
3) Introduzir DNA plasmídico, transportador de DNA, histamina, PEG e TE / CationMIXX (conferindo viscosidade e facilitando a adesão do DNA à célula);
4) Choque térmico e placa com meio de regeneração para permitir a reconstrução da parede celular e
crescimento das células transformadas.

56
Q

Quais são os métodos físicos existentes para a introdução e DNA em células animais ?

A

Eletroporação: A molécula de DNA sofre um choque elétrico e os poros permitem a entrada do DNA na célula. Depois da parede celular se reconstruir não é possível o DNA sair.

Biolística: bombardeamento das células com microprojéteis a alta velocidade, geralmente partículas de ouro (metais pesados) que foram revestidas com DNA ou RNA. Esses microprojéteis são disparados contra as células a partir de uma arma de partículas.

Microinjeção: Utiliza uma pipeta muito fina para injetar moléculas de DNA diretamente no núcleo
das células a serem transformadas;

57
Q

Quais os métodos químicos que permitem a inserção de DNA nas células dos animais?

A

Método do fosfato de cálcio: envolve a formação de um coprecipitado que é absorvido por endocitose; (Ca2+);

Fusão com lipossomas:adicionando lípidos à mistura contendo o DNA, formam-se micelas que
prendem o DNA no seu interior; essas vesículas fundem-se com a membrana celular e entram na
célula (degradado – lisossoma; núcleo – transfeção);

58
Q

Quais os métodos químicos utilizados na introdução de DNA em células vegetais ?

A

Uso de polietilenoglicol: causa a precipitação de DNA nas células. Usam-se protoplastos implicando a
regeneração da parede celular é necessária. Isso pode levar cerca de 15 dias, ­ risco de contaminação.

Entrega de genes bacterianos:baseado na atividade tumoral de bactérias Agrobacterium.
Técnica + comum. Opine synthesis – responsáveis pela libertação de aminoácidos para a rizosfera.
A bactéria usa isto como fonte de nutrientes.

59
Q

Quais os métodos físicos utilizados na introdução de DNA em células vegetais ?

A

Eletroporação- igual nas células animais

Biolística- igual nas células animais

Uso de protoplastos ( células sem parede celular)- é o + comum. A degradação da parede celular é alcançada através da atividade de várias celulases e peptidases.

60
Q

Quais as melhores estratégias para obter um clone de um gene desejado?

A

1) Seleção direta do gene desejado- A clonagem é feita de forma que os únicos
clones obtidos sejam clones com o gene
pretendido. A seleção ocorre ao nível do
plaqueamento.

2) Identificação do clone a partir de uma biblioteca de genes.Usa-se clonagem “shotgun”, para produzir
uma biblioteca de clones representando
todos ou a maioria dos genes presentes na
célula, seguido pela análise dos clones
individuais para identificação do correto

61
Q

O que é a biblioteca genómica?

A

Coleção de clones em número suficiente para conter todos os genes presentes de determinado organismo

62
Q

Sondagem de hibridação

A

Permite a identificação direta da molécula recombinante correta

63
Q

Hibridação in situ por fluorescência (FISH)

A

1) Sequências de DNA específicas nos cromossomas
2)Transcrições num tecido (ou células individuais)
FISH explora a capacidade de uma sonda fluorescente de hibridar especificamente uma cadeia de DNA com alto grau de complementaridade da sequência

64
Q

Passo a passo da metagenómica:

A

Estudo do material genético recuperado diretamente de amostras ambientais

  1. Separar as células das partículas do solo
  2. Lise celular
  3. Recuperar o DNA
  4. Fragmentar DNA e ligar a um vetor linearizado
  5. Introdução dos vetores num hospedeiro de clonagem bacteriana
  6. Selecionar e identificar clones com genes novos e úteis
65
Q

Passo a passo de cDNA

A
  1. Extração do mRNA e purificação
  2. Ligação com um poliprimer
  3. Transcriptase reversa atua e forma uma cadeia de cDNA
  4. RNAse III degrada parcialmente o RNA
  5. O RNA fragmentado pode ser usado como primer para a DNA polimerase I sintetizar a cadeia complementar ao cDNA
  6. Ligar a um vetor e clonado
66
Q

FISH + Microscopia de fluorescência

A

Ex: verificar se a bactéria é capaz de invadir o epitélio
Hibridação de ácidos nucleicos in situ, utilizando uma sonda de DNA marcada que se vai ligar ao rRNA da bactéria
1. Imobilização do tecido numa lâmina
2. Incubar com uma substância que permeabiliza as células
3. Incubação com as sondas fluorescentes que se vão ligar ao rRNA
4. Lavagem
5. Microscopia

67
Q

SOUTHERN HIBRIDIZATION (DNA-DNA); NORTHERN (DNA-RNA)

A

Ex: Mostrar que genes são co-transcritos (estão no mesmo operão) -NH
1. Extração do DNA/RNA
2. Separação do DNA/RNA em gel de agarose na presença de um agente desnaturante
3. Transferência do DNA do gel para uma membrana de nylon, imobilizando o DNA/RNA com UV
4. Bloqueio com DNA heterólogo e adição da sonda marcada, que pode ser o fragmento inteiro do gene a detetar
5. Hibridação e deteção
6. (Se quero detetar o fragmento e ele tem 5kb, tenho de ver se há algum assim; ou dois fragmentos unidos de
1 e 4kb, a sua união dá 5kb)

68
Q

Fatores que influenciam a hibridação

A

1) Aumento da temperatura
2) Concentração de sal
3) Solventes orgânicos
4) Comprimento da sonda
5)Conteúdo GC

Engenharia Genética (2 decks)

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