Chapitre 9 - Régulation eucaryote Flashcards
Qu’est-ce qui est différent entre la régulation chez les eucaryote et chez les procaryotes?
La transcription peut être régulée à tous les niveaux (initiation, élongation, terminaison, maturation). L’étape la plus sensible est l’initiation de la transcription. Comme chez les procaryotes, les protéines régulatrices sont des répresseurs et des activateurs de la transcription.
Les actions de ces protéines régulatrices sont complexifiées par des caractéristiques additionnelles des cellules et des gènes eucaryotes. :
1- LES NUCLÉOSOMES ET LES MODIFICATEURS DE LA CHROMATINE
2- PLUS DE RÉGULATEURS ET DE PLUS GRANDES SÉQUENCES RÉGULATRICES
3- VASTE INTÉGRATION DE SIGNAUX
Eucaryote : bcp de régulation sur la polymérase (empêcher ou augmenter la rapidité) lors de l’initiation.
Séquences régulateur en avant du promoteur (quelques centaines de bases devant, petit) : Procaryote
Promoteur basal et beaucoup de séquences régulatrice plus éloignées que bactérie : Levur
L’homme, multicellulaire : Promoteur proximal et devant possède plein de régulateurs près ou très loin, et après. Cela fait en sorte que c’est très difficile à étudier (comment savoir quelle sont les régulateurs? Jeux de hasard
Augmente la complexité
Nucléosome et histones bloquent l’accès à l’ARN pol., ce qui rend encore plus compliqué
Bcp plus de séquence régulatrice avec complexité de l’organisme (bactérie<levures<humains)
De plus en plus éloigné, peuvent être derrière le gène transcrit
Pas uniforme, pas séparé régulièrement (collé ou grand espace)
Compaction chez eucaryotes pas chez procaryotes interfère avec expression
De quoi est composé le promoteur eucaryote ?
1- ENHANCER (amplificateur) : séquence d’ADN qui fixe des facteurs régulateurs de transcription, ce qui a pour conséquence d’augmenter la transcription de gènes situés en aval ou en amont. Les enhancers peuvent agir à une grande distance des gènes. Site de liaison facteurs de transcription spécifique. Réponse à un signal spécifique. Normalement, des endroits où des FT activateurs peuvent venir se lier. Peuvent agir sur de grandes distances. En formant une boucle on peut se rapprocher du site d’initiation de la transcription
2- ISOLATEUR (Insulator) : élément spécifique d’ADN contrôlant l’action des activateurs. Situé entre un enhancer et un promoteur, un isolateur inhibe l’activation du gène induite par l’activateur. Relativement récent. Répresseur peut venir s’y lier et empêcher les protéines se liant à l’enhancer de venir faire leur action. Équivalent d’un opérateur chez bactérie sauf que ce dernier était très proche et interférait avec pol, ici il est insérer entre un enhancer et un promoteur distal, peut bloquer son action
3- Promoteur basal où GTF se lient
4- Promoteur proximal : FT s’y lie permettant l’expression ou non (répresseur ou activateur
Les sites de liaison des régulateurs de transcription ne sont pas nécessairement distribués de manière homogène sur le promoteur.
Ajout d’élément avant ou après le gène
Expliquez ce qu’est l’analyse par délétion
L’analyse par délétion ou ajout de séquences régulatrices permet de mieux comprendre les fonctions des promoteurs et de les délimiter.
Coloration sur les feuilles d’une plante exprimant le gène rapporteur par rapport aux délétions (promoteur en fonction de leur délétion, expression du gène)
Les promoteurs sur les eucaryotes sont difficile à analyser car très long, et certains endroit, il peut y avoir «rien». Où sont séquences régulatrices? Où est le gène etc.?
Expérience de délétion de promoteurs : (1) Enlève la «boite C» (2) on enlève la boîte ID et B en gardant la boîte C (3) On garde uniquement boite A et C (4) on enlève la boite A en gardant la boîte C.
Résultats :
1-Promoteur sauvage : expression moyenne du gène
2-Sans boite c : pas d’expression du gène, la boîte C était un régulateur
3- Sans boite ID/B : grande expression su gène : les boites ID et B étaient des répresseurs
4- Uniquement boite C et A : grande expression du gène : C et A sont les seuls permettant l’expression du gène
5- Sans boite A (uniquement C) : on a enlever le promoteur basal, pas d’expression, C est uniquement régulateur
Comment peut-on étudier les séquences régulatrices?
Afin de pouvoir étudier les séquences régulatrices, on utilise les gènes rapporteurs. Il s’agit de gènes qui codent des protéines dont la présence se mesure facilement.
Le gène rapporteur :
1-Doit être étranger au génome de l’organisme modifié.
2-Doit permettre une visualisation précise de l’expression dans les tissus.
3-Le résultat doit être quantifiable afin de mesurer l’activité du promoteur.
*GFT : gènes rapporteurs : nous permettant de localiser certaines protéines. Capacité de visualiser l’organise dans lequel la protéine est dirigée
*Gène rapporteurs permettant de voir le lieu d’expression dans un tissus : Création d’un mutant en enlevant la séquence du gène d’intérêt et remplacement par une enzyme qui émet de la lumière ou un composé coloré ou détectable par anticorps pour faire imunocytochimie. Garder même promoteur comme ça exprimé au même proportion.
*L’enzyme rapporteur doit être étranger
Permet de localiser certaines protéines ou visualiser le lieu d’expression dans les tissus à l’aide d’un mutant qui fait de la lumière (fluorescence), composé coloré ou détectable par anticorps
Normalement, qu’est-ce qu’est le gène rapporteur?
Très souvent, il s’agit d’une enzyme dont il est facile de mesurer l’activité.
Exemple :
GÈNE RAPPORTEUR GUS
Enzyme du génome d’E.coli (≠LacZ !)
GUS : enzyme
Donne son substrat : émet du bleu
Quantifiable en fonction de la concentration. (Très sensible)
On s’en sert pour faire les analyse des promoteurs, par exemple
Quantifiables en fonction des mutations et facilement visualisable, même au niveau cellulaire
Comment peut-on voir les résultats de l’analyse de l’impact des séquences régulatrice par gène rapporteur?
Avec des + ou graphiquement puisque facilement quantifiable
Comment peut-on observer une protéine?
Il est possible d’ajouter des « tags » ou un marqueur (étiquette) à une protéine. C’est alors la protéine de fusion que nous allons observer. Ajout d’une partie au gêne exprimant de la fluorescence ou étant reconnu par un anticorps afin d’observer si un gène (et donc la protéine de fusion) est exprimé en modifiant le promoteur
Permet de faire des image de microscopie à fluorescence
Marquer des cellules par rapport à ces concentration en protéine, ou bien de localiser les protéines
Quelle caractéristique des activateurs et des répresseurs sont pertinent pour étudier leur fonctionnement? Donnez un exemple
Les activateurs et les répresseurs sont modulaires, composés d’un domaine liant l’ADN et d’un domaine d’activation ou d’inhibition.
Gal4 : active la transcription des enzymes nécessaire au métabolisme du galactose chez la levure.
Lie quatre sites situés 275 pb en amont de Gal1 et, en présence de galactose, Gal4 active la transcription du gène x1000.
Si on exprime seulement le premier 1⁄3 N- terminal de Gal4, la protéine produite lie normalement l’ADN mais n’active pas la transcription.
Le domaine de liaison à l’ADN permet simplement de cibler la région activatrice de la protéine sur le promoteur
Les protéines régulatrices sont hautement modulaire (2 modules complètement indépendant l’un à l’autre)
1- Un module se liant à l’ADN
2- Un module d’activation/inhibition
Cette modularité est pertinente en labo.
Facteur d’activation de Gal4 capable d’activer le gêne lacZ.
Création de chimères pour comprendre différents modules.
Protéine souvent modulaire: composé principalement de 2 domaines, un liant l’ADN et spécifique à des séquences du promoteur
Un domaine d’activation ou d’inhibition souvent de manière indirect (chromatine, FTG, médiateurs)
Utilisation de lacZ comme gène rapporteur
En enlevant différant domaine, voir modulation de l’activité, création de chimère pour activation avec un domaine de liaison différent, encore activation mais site de liaison différent
De quoi la majorité des domaines capables de reconnaitre l’ADN des protéines régulatrices sont-elles formées?
Les eucaryotes ont différents domaines capables de reconnaître l’ADN. La majorité est formée d’une hélice qui s’insère dans le sillon majeur (comme hélice-coude-hélice bactérienne).
Dans tous les cas, il y a une hélice alpha qui se lie au salon majeur de l’ADN
Sillon majeur : séquence spécifique
Nommez les 4 sortes de domaines de liaison à l’ADN des protéines régulatrices?
1- L’homéodomaine
2- Le doigt de zinc
3- L’agrafe à leucine (“leucine zipper”)
4- L’hélice-boucle-hélice
Qu’est-ce que l’homéodomaine?
Est constitué de plusieurs hélices : une (1) reconnait la séquence d’ADN dans le sillon majeur et les autres (plusieurs) servent au bon positionnement sur la charpente.
Forme souvent des hétérodimères (2 protéines différentes)
—> Ressemble bcp à hélice-coude-hélice
Qu’est-ce que le doigt de zinc?
Utilise un atome de zinc pour stabiliser l’hélice alpha qui s’insère dans le sillon majeur de l’ADN (zinc fait des liaisons avec les a.a. cystéine et histidine et ainsi modifie la structure 3D de la protéine régulatrice). Une protéine régulatrice peut contenir plusieurs doigts de zinc les unes à la suite des autres, allongeant d’autant la séquence d’ADN reconnue.
D’autres motifs utilisent le zinc, mais toujours pour stabiliser leur structure.
Plusieurs doigts de zinc s’insérant dans plusieurs sillon majeur se suivant possible
Permet de reconnait séquence plus longue donc plus spécifique
Qu’est-ce que l’agrafe à leucine?
Formée de 2 longues hélices α qui s’insèrent dans des sillons majeurs voisins (un demi-tour entre les deux).
La dimérisation est induite par une autre région au sein de ces mêmes hélices : dans cette région, elles forment des courts tronçons bispiralés, au sein desquels les deux hélices restent associées par des interactions hydrophobes entre des résidus leucine (ou autres résidus hydrophobes) espacés de façon appropriée
Les deux hélices s’enroulent une sur l’autre.
Elles peuvent former des homo ou des hétérodimères.
Dimère (homo ou hétéro) qui contient chacune une séquence spécifique de l’ADN au niveau du sillon majeur (hélices) et 2 autre hélices très petites composés de leucine hydrophobes qui ont tendance à s’enrouler ensemble (interaction hydrophobe) formant un supercoiled très enroulé
Hélice alpha dans les sillon majeur et coiled coil hydrophobe en bas
Besoin des 2 protéines pour fonctionner (homo ou hétéro dimère)
Qu’est-ce qu’est l’hélice-boucle-hélice?
Ressemble à l’agrafe à leucine, mais elle est formée par 4 hélices alpha qui sont reliées via une région relâchée (la boucle)
L’association entre les 2 sous- unités se fait par des régions riches en leucines présentes sur les deux hélices (celle qui lie l’ADN et la 2e plus petite).
Ces deux motifs ont une unité structurale déjà dimérique. Ils combinent la dimérisation à la formation d’une surface de contact avec l’ADN.
bHLH. Ne ressemble pas du tout à hélice-coude-hélice de la bactérie. Le plus complexe : Dimères imbriquées l’un dans l’autre. Hélices alpha dans sillon majeur (2).
2 protéines liés ensemble par une boucle (dimère qui ressemble à une seule protéine, tellement bien liés)
Les facteurs reconnaissent des séquences précises
Comment sont définies les domaines activateurs ?
Ils sont relativement peu structurés. On pense qu’ils forment plutôt des
surfaces adhésives capables d’interagir avec plusieurs autres protéines.
On les définit habituellement sur la base de leur contenu en acides aminés. Par exemple, le domaine « acide » contient plusieurs acides aminés acides comme l’acide aspartique (D) ou glutamique (E).
Comment les activateurs agissent ?
Les activateurs agissent rarement directement sur l’ARN pol.
Ils peuvent recruter indirectement la polymérase à travers le complexe médiateur ou des facteurs généraux de la transcription.
Ils peuvent recruter des facteurs modificateurs des histones qui altèrent la chromatine pour permettre l’accès à des sites de liaison spécifiques sur l’ADN.
Soit recrute des TFII (D, puis B…)
Soit recruter médiateur pour décondenser l’ADN (recruté par des facteurs de transcription activateurs)
Permet de dérouler l’ADN où les facteurs généraux vont se lier
Quels sont les différents mécanismes d’action des répresseurs?
Ils peuvent agir de plusieurs façons :
Interférer avec les activateurs (compétition pour le site de liaison ou blocage)
Interagir avec le complexe d’initiation (à travers le complexe médiateur) et inhiber la transcription
Compacter la chromatine et rendre les gènes inaccessibles (recrutement des protéines capables de modifier la chromatine)
Soit on se lie sur un site très très proche de l’activateur (empêchement physique) compétition de liaison
Soit chacun sur site de liaison et le répresseur se lie à l’activateur et l’empêche de fonctionner
Represseur peut également recrute le complexe médiateurs pour refermer l’ADN
Les répresseurs peuvent réprimer la compaction de l’ADN (protéine compactant l’ADN et empêche l’expression du gêne)
Peuvent également empêcher l’ouverture de la polymérase
Comment, en règle générale, la modification des histones peut réguler la transcription?
Les histones formant les nucléosomes peuvent être modifiées de manière post-traductionnelle. (Les complexes remodelants) :
L’ajout du CH3 sur la queue des histones provoque une répression de la transcription. La queue méthylée recrute des protéines responsables de la formation d’hétérochromatine. L’ajout d’un groupement méthyle (CH3) provoque une répression de la transcription (formation d’hétérochromatine)
L’ajout d’acétyle ou du P sur la queue des histones neutralise la charge (+) de l’histone et elle interagit moins bien avec l’ADN → l’ADN peut être déroulé plus facilement. L’ajout d’acétyle ou d’un groupement phosphate neutralise la charge des histones et permet un accès facilité à l’ADN. Augmente la transcription.
Lorsque les histone sont acétylées, enlève charge + et décompaction. Histone acétyles permet la transcription : 1- Déstabilise la liaison du nucléosome avec l’ADN (un peu plus libre)
2- Queue des histones acétyles permet le recrutement de facteurs de transcription qui contiennent des bromodomaines
Méthylation réprime la transcription
Acétylation et phosphoprylation active la transcription
Comment peut se faire et quel est le résultat d”une méthylation sur l’ADN?
L’ajout de groupement méthyle (CH3) directement sur l’ADN (au niveau des cytosines ou adénines) marque la région pour la formation d’hétérochromatine
Lors de la division cellulaire, les groupements méthyles sont maintenus et leur présence active la méthylation du brin complémentaire.
Processus d’extinction de gènes par épigénétique
Méthylation peut se faire directement sur l’ADN (certaines cytosines de l’ADN) et permet la formation en hétérochromatine directement,
Méthylation sur la queue d’histone entraîne la compactions également
Méthylation est un signal de compaction de l’ADN, réprime l’expression
Méthylation recrute des protéine se liant sur l’ADN pour hétérochromatinee
Épigénétiques, distribuer aux cellules filles
Expliquez en détail l’acétylation des histones
Les histone acétyl transférases sont recrutées par des activateurs sur des régions précises de l’ADN. Une fois la chromatine déroulée, le promoteur devient accessible et la transcription peut débuter.
+ Recrutement de facteurs spécifiques. L’addition d’un groupement acétyle peut créer un site de liaison pour des protéines contenant des bromodomaines.
Un bromodomaine est un motif de 4 hélices α capable de s’attacher sur les histones acétylées.
Une des sous-unités de TFIID contient un bromodomaine, donc TFIID peut se lier plus facilement à un promoteur situé sur un nucléosome acétylé.
Bromodomaine : Complexe qui reconnait spécifiquement les queues d’histone acétylées. Ex : TFIID contient un bromodomaine, se lie préférentiellement où il y a des histones acétylées
Quand est-ce que le complexe FACT peut faire effet?
Uniquement lors de l’élongation
Que sont les complexes remodeleur de la chromatine ?
Ils sont recrutés par :
les facteurs de transcription
les queues N-terminales des histones Ils ont besoin de l’ATP pour fonctionner.
L’énergie est utilisée pour permettre une redistribution des liens entre l’ADN et les histones.
Les nucléosomes sont tenus par des liens non-covalents (surtout liens H)
Ils peuvent être “transférés” vers un autre brin.
L’ADN peut déroulé légèrement par “glissement”.
Mains qui marchent sur l’ADN
Recrutés aussi par les complexes médiateurs
Expliquez ce qu’est l’extinction des gènes
Certains gènes sont maintenus silencieux par méthylation de l’ADN de leur région promotrice.
De grandes portions du génome peuvent être méthylées et l’ADN des régions hétérochromatiques est souvent méthylé.
Les séquences méthylées sont reconnues par des protéines spécifiques. Ces protéines recrutent des histones désacétylases et des histones méthylases qui modifient la chromatine (formation de l’hétérochromatine) et rendent la région impossible à transcrire.
Lorsqu’on veut rendre un gêne complètement silencieux, on ajoute des méthyliques sur les cytosines directement sur l’ADN, permettant de recruter des protéines qui se lient sur l’ADN méthylé et la compacte pour toute la vie de la cellule (hétérochromatine pour «toujours»
Rend le gène complètement silencieux
On ne peut plus décompacter à ce moment. Par contre, on peut démythler
Expliquez le principe de la coordination de l’expression génique
Un même facteur peut agir sur plusieurs gènes et la plupart des gènes eucaryotes sont sous le contrôle de multiples éléments. Différentes combinaisons de facteurs assurent le contrôle et la coordination de l’ensemble des gènes.
Même concept que chez les bactéries, mais avec + de variables…
Pour permettre l’expression d’un gêne, demande une combinaison de facteurs
Contrôle combinatoire : plusieurs gènes sous le contrôle d’un même facteur. En absence du glucose,
les opérons Lac et Gal sont activés par CAP. Surtout des gênes du développement –>Régulé de façon extrême
Intégration du signal : deux conditions (ou plus) sont nécessaires pour obtenir la pleine expression des opérons Lac (présence lactose et absence glucose) ou Gal (présence de galactose et absence de glucose).
Ex : Le développement des 4 parties de la fleurs (sépales, pétales, étamines et carpelle) est par la présence coordonnée de différents facteurs de transcription bien spécifiques.
Une fleur possède 4 structures qui se développent.
Demande l’interaction de plusieurs facteurs de transcription
Certaines de ces structures ont besoin de l’expression de gènes semblables
Contrôle combinatoire : certains présents partout, certains à un seul endroit
Important d’avoir intégration du signal
