Chapitre 9 - Régulation eucaryote Flashcards
Qu’est-ce qui est différent entre la régulation chez les eucaryote et chez les procaryotes?
La transcription peut être régulée à tous les niveaux (initiation, élongation, terminaison, maturation). L’étape la plus sensible est l’initiation de la transcription. Comme chez les procaryotes, les protéines régulatrices sont des répresseurs et des activateurs de la transcription.
Les actions de ces protéines régulatrices sont complexifiées par des caractéristiques additionnelles des cellules et des gènes eucaryotes. :
1- LES NUCLÉOSOMES ET LES MODIFICATEURS DE LA CHROMATINE
2- PLUS DE RÉGULATEURS ET DE PLUS GRANDES SÉQUENCES RÉGULATRICES
3- VASTE INTÉGRATION DE SIGNAUX
Eucaryote : bcp de régulation sur la polymérase (empêcher ou augmenter la rapidité) lors de l’initiation.
Séquences régulateur en avant du promoteur (quelques centaines de bases devant, petit) : Procaryote
Promoteur basal et beaucoup de séquences régulatrice plus éloignées que bactérie : Levur
L’homme, multicellulaire : Promoteur proximal et devant possède plein de régulateurs près ou très loin, et après. Cela fait en sorte que c’est très difficile à étudier (comment savoir quelle sont les régulateurs? Jeux de hasard
Augmente la complexité
Nucléosome et histones bloquent l’accès à l’ARN pol., ce qui rend encore plus compliqué
Bcp plus de séquence régulatrice avec complexité de l’organisme (bactérie<levures<humains)
De plus en plus éloigné, peuvent être derrière le gène transcrit
Pas uniforme, pas séparé régulièrement (collé ou grand espace)
Compaction chez eucaryotes pas chez procaryotes interfère avec expression
De quoi est composé le promoteur eucaryote ?
1- ENHANCER (amplificateur) : séquence d’ADN qui fixe des facteurs régulateurs de transcription, ce qui a pour conséquence d’augmenter la transcription de gènes situés en aval ou en amont. Les enhancers peuvent agir à une grande distance des gènes. Site de liaison facteurs de transcription spécifique. Réponse à un signal spécifique. Normalement, des endroits où des FT activateurs peuvent venir se lier. Peuvent agir sur de grandes distances. En formant une boucle on peut se rapprocher du site d’initiation de la transcription
2- ISOLATEUR (Insulator) : élément spécifique d’ADN contrôlant l’action des activateurs. Situé entre un enhancer et un promoteur, un isolateur inhibe l’activation du gène induite par l’activateur. Relativement récent. Répresseur peut venir s’y lier et empêcher les protéines se liant à l’enhancer de venir faire leur action. Équivalent d’un opérateur chez bactérie sauf que ce dernier était très proche et interférait avec pol, ici il est insérer entre un enhancer et un promoteur distal, peut bloquer son action
3- Promoteur basal où GTF se lient
4- Promoteur proximal : FT s’y lie permettant l’expression ou non (répresseur ou activateur
Les sites de liaison des régulateurs de transcription ne sont pas nécessairement distribués de manière homogène sur le promoteur.
Ajout d’élément avant ou après le gène
Expliquez ce qu’est l’analyse par délétion
L’analyse par délétion ou ajout de séquences régulatrices permet de mieux comprendre les fonctions des promoteurs et de les délimiter.
Coloration sur les feuilles d’une plante exprimant le gène rapporteur par rapport aux délétions (promoteur en fonction de leur délétion, expression du gène)
Les promoteurs sur les eucaryotes sont difficile à analyser car très long, et certains endroit, il peut y avoir «rien». Où sont séquences régulatrices? Où est le gène etc.?
Expérience de délétion de promoteurs : (1) Enlève la «boite C» (2) on enlève la boîte ID et B en gardant la boîte C (3) On garde uniquement boite A et C (4) on enlève la boite A en gardant la boîte C.
Résultats :
1-Promoteur sauvage : expression moyenne du gène
2-Sans boite c : pas d’expression du gène, la boîte C était un régulateur
3- Sans boite ID/B : grande expression su gène : les boites ID et B étaient des répresseurs
4- Uniquement boite C et A : grande expression du gène : C et A sont les seuls permettant l’expression du gène
5- Sans boite A (uniquement C) : on a enlever le promoteur basal, pas d’expression, C est uniquement régulateur
Comment peut-on étudier les séquences régulatrices?
Afin de pouvoir étudier les séquences régulatrices, on utilise les gènes rapporteurs. Il s’agit de gènes qui codent des protéines dont la présence se mesure facilement.
Le gène rapporteur :
1-Doit être étranger au génome de l’organisme modifié.
2-Doit permettre une visualisation précise de l’expression dans les tissus.
3-Le résultat doit être quantifiable afin de mesurer l’activité du promoteur.
*GFT : gènes rapporteurs : nous permettant de localiser certaines protéines. Capacité de visualiser l’organise dans lequel la protéine est dirigée
*Gène rapporteurs permettant de voir le lieu d’expression dans un tissus : Création d’un mutant en enlevant la séquence du gène d’intérêt et remplacement par une enzyme qui émet de la lumière ou un composé coloré ou détectable par anticorps pour faire imunocytochimie. Garder même promoteur comme ça exprimé au même proportion.
*L’enzyme rapporteur doit être étranger
Permet de localiser certaines protéines ou visualiser le lieu d’expression dans les tissus à l’aide d’un mutant qui fait de la lumière (fluorescence), composé coloré ou détectable par anticorps
Normalement, qu’est-ce qu’est le gène rapporteur?
Très souvent, il s’agit d’une enzyme dont il est facile de mesurer l’activité.
Exemple :
GÈNE RAPPORTEUR GUS
Enzyme du génome d’E.coli (≠LacZ !)
GUS : enzyme
Donne son substrat : émet du bleu
Quantifiable en fonction de la concentration. (Très sensible)
On s’en sert pour faire les analyse des promoteurs, par exemple
Quantifiables en fonction des mutations et facilement visualisable, même au niveau cellulaire
Comment peut-on voir les résultats de l’analyse de l’impact des séquences régulatrice par gène rapporteur?
Avec des + ou graphiquement puisque facilement quantifiable
Comment peut-on observer une protéine?
Il est possible d’ajouter des « tags » ou un marqueur (étiquette) à une protéine. C’est alors la protéine de fusion que nous allons observer. Ajout d’une partie au gêne exprimant de la fluorescence ou étant reconnu par un anticorps afin d’observer si un gène (et donc la protéine de fusion) est exprimé en modifiant le promoteur
Permet de faire des image de microscopie à fluorescence
Marquer des cellules par rapport à ces concentration en protéine, ou bien de localiser les protéines
Quelle caractéristique des activateurs et des répresseurs sont pertinent pour étudier leur fonctionnement? Donnez un exemple
Les activateurs et les répresseurs sont modulaires, composés d’un domaine liant l’ADN et d’un domaine d’activation ou d’inhibition.
Gal4 : active la transcription des enzymes nécessaire au métabolisme du galactose chez la levure.
Lie quatre sites situés 275 pb en amont de Gal1 et, en présence de galactose, Gal4 active la transcription du gène x1000.
Si on exprime seulement le premier 1⁄3 N- terminal de Gal4, la protéine produite lie normalement l’ADN mais n’active pas la transcription.
Le domaine de liaison à l’ADN permet simplement de cibler la région activatrice de la protéine sur le promoteur
Les protéines régulatrices sont hautement modulaire (2 modules complètement indépendant l’un à l’autre)
1- Un module se liant à l’ADN
2- Un module d’activation/inhibition
Cette modularité est pertinente en labo.
Facteur d’activation de Gal4 capable d’activer le gêne lacZ.
Création de chimères pour comprendre différents modules.
Protéine souvent modulaire: composé principalement de 2 domaines, un liant l’ADN et spécifique à des séquences du promoteur
Un domaine d’activation ou d’inhibition souvent de manière indirect (chromatine, FTG, médiateurs)
Utilisation de lacZ comme gène rapporteur
En enlevant différant domaine, voir modulation de l’activité, création de chimère pour activation avec un domaine de liaison différent, encore activation mais site de liaison différent
De quoi la majorité des domaines capables de reconnaitre l’ADN des protéines régulatrices sont-elles formées?
Les eucaryotes ont différents domaines capables de reconnaître l’ADN. La majorité est formée d’une hélice qui s’insère dans le sillon majeur (comme hélice-coude-hélice bactérienne).
Dans tous les cas, il y a une hélice alpha qui se lie au salon majeur de l’ADN
Sillon majeur : séquence spécifique
Nommez les 4 sortes de domaines de liaison à l’ADN des protéines régulatrices?
1- L’homéodomaine
2- Le doigt de zinc
3- L’agrafe à leucine (“leucine zipper”)
4- L’hélice-boucle-hélice
Qu’est-ce que l’homéodomaine?
Est constitué de plusieurs hélices : une (1) reconnait la séquence d’ADN dans le sillon majeur et les autres (plusieurs) servent au bon positionnement sur la charpente.
Forme souvent des hétérodimères (2 protéines différentes)
—> Ressemble bcp à hélice-coude-hélice
Qu’est-ce que le doigt de zinc?
Utilise un atome de zinc pour stabiliser l’hélice alpha qui s’insère dans le sillon majeur de l’ADN (zinc fait des liaisons avec les a.a. cystéine et histidine et ainsi modifie la structure 3D de la protéine régulatrice). Une protéine régulatrice peut contenir plusieurs doigts de zinc les unes à la suite des autres, allongeant d’autant la séquence d’ADN reconnue.
D’autres motifs utilisent le zinc, mais toujours pour stabiliser leur structure.
Plusieurs doigts de zinc s’insérant dans plusieurs sillon majeur se suivant possible
Permet de reconnait séquence plus longue donc plus spécifique
Qu’est-ce que l’agrafe à leucine?
Formée de 2 longues hélices α qui s’insèrent dans des sillons majeurs voisins (un demi-tour entre les deux).
La dimérisation est induite par une autre région au sein de ces mêmes hélices : dans cette région, elles forment des courts tronçons bispiralés, au sein desquels les deux hélices restent associées par des interactions hydrophobes entre des résidus leucine (ou autres résidus hydrophobes) espacés de façon appropriée
Les deux hélices s’enroulent une sur l’autre.
Elles peuvent former des homo ou des hétérodimères.
Dimère (homo ou hétéro) qui contient chacune une séquence spécifique de l’ADN au niveau du sillon majeur (hélices) et 2 autre hélices très petites composés de leucine hydrophobes qui ont tendance à s’enrouler ensemble (interaction hydrophobe) formant un supercoiled très enroulé
Hélice alpha dans les sillon majeur et coiled coil hydrophobe en bas
Besoin des 2 protéines pour fonctionner (homo ou hétéro dimère)
Qu’est-ce qu’est l’hélice-boucle-hélice?
Ressemble à l’agrafe à leucine, mais elle est formée par 4 hélices alpha qui sont reliées via une région relâchée (la boucle)
L’association entre les 2 sous- unités se fait par des régions riches en leucines présentes sur les deux hélices (celle qui lie l’ADN et la 2e plus petite).
Ces deux motifs ont une unité structurale déjà dimérique. Ils combinent la dimérisation à la formation d’une surface de contact avec l’ADN.
bHLH. Ne ressemble pas du tout à hélice-coude-hélice de la bactérie. Le plus complexe : Dimères imbriquées l’un dans l’autre. Hélices alpha dans sillon majeur (2).
2 protéines liés ensemble par une boucle (dimère qui ressemble à une seule protéine, tellement bien liés)
Les facteurs reconnaissent des séquences précises
Comment sont définies les domaines activateurs ?
Ils sont relativement peu structurés. On pense qu’ils forment plutôt des
surfaces adhésives capables d’interagir avec plusieurs autres protéines.
On les définit habituellement sur la base de leur contenu en acides aminés. Par exemple, le domaine « acide » contient plusieurs acides aminés acides comme l’acide aspartique (D) ou glutamique (E).
