Chapitre 31 - Séparations Flashcards
quels sont les objectifs de la chromatographie?
Simplifier des mélanges complexes, purification, isolation de molécules d’intérêts (car en petites quantité), Débarrasser des interférences.
Qu’est-ce qui détermine l’étendue de la séparation?
la nature et l’importance des interactions entre les constituants des mélanges, la phase mobile et la phase solide.
Expliquer le fonctionnement d’une LC classique sur colonne
- Échantillon sur dessus et puis solvant introduit
- Les composantes se déplace à vitesses différentes en fonction de leur affinité pour la phase stationnaire
- Fractions récupérées
- Solvant évaporer les substances purifiées - étude quanti ou quali.
Décrire les distinctions de la LC moderne
Introduction: auto-échantillonneur
Mouvement solvant: pompes mécaniques
Colonne et sorbant: cylindre métallique
Détection: En ligne via différentes méthodes
Analyse: automatique du chromatogramme (par ordinateur)
Quelles sont les différentes composantes d’une LC moderne?
Réservoir à solvant, pompe, échantillon, valve d’injection, colonne, détecteur
Qu’est-ce qu’un chromatogramme?
courbe montrant la variation du signal du détecteur en fonction du temps de la séparation par chromatographie.
Quels interactions moléculaires sont à la base d’une RPLC?
Interactions de dispersion (London): déformation du nuage électronique et formation d’un dipôle instantanné; grande molécule tendance à s’agglomérée ensemble.
Quels sont les 3 interactions qui contrôle le passage du soluté à travers la colonne?
Phase mobile - soluté
Phase stationnaire - soluté
Phase mobile - phase stationnaire
Définir temps de rétention (Tr)
Temps qu’un composé prend pour se rendre au détecteur. Entre l’injection de l’échantillon et le maximum pic d’élution
définir temps mort (To)
temps minimum nécessaire pour que la phase mobile non retenu se rende au détecteur
Définir temps de rétention ajusté (T’r)
Le temps que l’analyte est retenue dans la colonne
T’r = Tr - To
A quoi est dû les différences de temps de rétention?
Aux interactions de l’analyte avec la phase stationnaire
Pourquoi le coefficient de sélectivité de 2 composés à séparer doit être différente de 1?
Car si coefficient est égale à 1, cela signifie qu’ils ont les même temps de rétention donc les 2 composés vont sortir en même temps = pas de séparation
Définir volume mort (Vo)
Volume inerte du système chromatographique occupé par la phase mobile, incluant le volume à l’intérieur et à l’extérieur des particules de la colonne
3 caractéristiques d’un chromatogramme?
- solutés séparés sont observés sous forme de pic
- L’aire sous la courbe des pics est proportionnelle à la concentration de chaque soluté
- Les pics qui sortent en 2e sont moins retenus que ceux qui sortent en dernier
Qu’est-ce que l’efficacité d’une colonne chromatographique?
La capacité à fournir des pics étroits pour les solutés élués (efficacité de séparation).
Toujours par rapport au nombre de plateau théorique (N)
Plus N est grand, plus la colonne est efficace
Quels facteurs affectent la pression dans une colonne?
augmentation de la pression pour augmenter la vitesse de séparation (UPLC meilleure séparation), largeur des particules (petites = haute pression), longueur de la colonne (plus longue = haute pression).
quels sont les 2 facteurs principaux d’une chromatographie réussie?
- Largeur des pic à la base (W); plus étroit = meilleur séparation
- Différence entre les temps de rétention: pics doivent être séparés à la base.
Qu’est-ce que la RPLC?
Phase stationnaire apolaire: C18
Phase mobile polaire: mélange eau et solvant organique miscible dans l’eau
Pourquoi est-il important d’avoir de l’eau dans la phase mobile?
Car nous cherchons à avoir une bonne distribution entre la PS et PM. Un bon partage = 2 phases aux extrêmes
Si PM trop similaire à PS: k plus petit que 1 = mauvaise séparation.
Comment contrôler la rétention?
Change le %B. une augmentation du %B mène à une diminution du temps de rétention de tous les composés et du temps d’analyse
Comment modifier la sélectivité du système?
Modifie les temps de rétention
Comment modifier la résolution du système?
Change le ratio eau/solvant (A/B)
Qu’est-ce que le phénomène de diffusion?
Plus analyte passe de temps dans la colonne, plus il y a diffusion; la hauteur de la bande diminue mais l’aire sous la courbe reste la même.
Quels sont les effets de la température?
Le Tr varie en fonction de la température, sont contrôle est donc important pour une bonne reproductibilité.
Quelles sont les composante d’une HPLC?
Solvants, module de ctl manuel, dégasseur, pompe, injecteur, compartiment thermostaté pour la colonne, détecteur (UV , FLD)
Distinguer élution isocratique vs par gradient
Isocratique: %B identifique tout au long de l’élution
Par gradient: composition PM modifier en fonction du temps (de faible à élevée).
Ceci permet de raccourcir le temps de séparation
Qu’est-ce que le temps d’équilibrage (Te)?
Temps pour que la colonne retrouve un %B identique à celui au début de l’analyse
Généralement = 10 x To
Quelles sont les propriétés les plus importantes lors du choix d’un tampon?
Pka et pouvoir tampon, solubilité dans les 2 phases, volatilité, absorbance dans UV, stabilité, capacité à formé des pairs d’ions.
Quel est le but d’une séparation chromatographique?
obtenir la séparation la plus rapide possible permettant une séparation adéquates des pics des analytes.
Quoi faire lors d’une faible rétention d’un composé polaire?
Si les solutés se trouvent sous la forme d’ions; utiliser des agents d’appariement
Quoi faire si il y a des pics non-observables?
absence de pic est souvent dû au manque de sensibilité du détecteur ou du chevauchement avec des pics de signal élevée (utiliser un détecteur plus sensible ou sélectif).
Quel est l’effet de la masse de l’échantillon?
Si elle est trop grande = cause une surcharge de la colonne. Ceci sature les sites de sorptions
