Chapitre 2 : Outils et méthodes Flashcards
Qu’est ce qu’un artéfact ?
C’est une structure artificielle apparaissant lors de la préparation d’un échantillon pour son observation au microscope.
Qu’est ce qui peut causer un artéfact ?
Les fixateurs peuvent causer la précipitation ou coagulation de substances normalement dépourvues de structure dans la cellule et créer des artéfacts.
Comment prouver qu’une structure observée au microscope n’est pas un artéfact ?
Il faut préparer les échantillons de différentes façons avec différents fixateurs ou sans fixateur (congélation rapide et cryodécapage).
Qu’est ce que le grossissement stérile ou efficace ?
Un grossissement efficace est un grossissement avec une résolution claire et précise qui permet d’observer efficacement l’échantillon. À l’inverse un grossissement stérile est flou, pas net et imprécis et ne permet pas d’observer de manière efficace un échantillon. C’est pour ça que pour de petites structures, l’on privilégie le microscope électronique au microscope optique/photonique.
Qu’est ce que la limite de résolution ?
C’est une expression quantitative de la capacité de grossissement efficace d’un appareil optique.
Comment se calcule la limite de résolution ?
d = 0,61λ / O.N.
d : limite de résolution en nm
λ : longueur d’onde en nm
O.N. : l’ouverture numérique
Comment se calcule l’ouverture numérique ?
O.N. = n × sin α
n : indice de réfraction
α : demi-angle d’ouverture du cône lumineux
Quel est le lien entre la longueur d’onde et la résolution ?
Plus la longueur d’onde est petite, plus la limite de résolution est petite donc la résolution et le grossissement efficace sont meilleurs. Pour O.N. = 1.4 :
d = 174 pour 400 nm contre d = 218 pour 500 nm
Quelles solutions peut on apporter pour avoir un grossissement efficace ?
En lumière visible, on peut améliorer la limite de résolution en éclairant la préparation avec de courtes longueurs d’onde comme la lumière bleue, voir même basculer en lumière ultraviolette et baisser à 200 nm.
Quels sont les inconvénients de la lumière ultraviolette en microscopie ?
Il faut un optique en quartz et non en verre (car le verre est opaque aux UV), un miroir à première surface (car sa ouche métallique est non
recouverte de verre) et elle est invisible pour l’œil humain.
Quelles sont les caractéristiques du MET ?
Le MET ou microscope électronique à transmission utilise un faisceau d’électrons comme source d’éclairage ce qui améliore la limite de résolution (même formule que microscope optique). Ce faisceau est produit par un filament de tungstène (en haut) qui produit les électron par émission thermoélectronique quand il est chauffé. Le MET a un hublot avec plaque phosphorescente pour pouvoir observer l’échantillon : les électrons sont absorbés par la plaque qui émet de la lumière, ce qui permet de voir l’image formée en temps réel.
Comment calculer la longueur d’onde au MET ?
λ = h / mv = 1.23 / √V
h : une constante toujours égale à 1.23
V : voltage
m : masse de la particule (électron, proton…)
v : vitesse de cette particule
Quelles sont les valeurs standards de limites de résolution et de voltage au MET ?
Souvent, au MET, la limite de résolution tourne entre 0.1 et 0.3 nm et le voltage de 10 à 120 kV.
Comment prépare-t-on un échantillon pour la coupe au microtome ?
On dépose d’abord l’échantillon dans une solution de fixateur, puis dans des bains d’alcool de concentrations croissantes, qui vont remplacer toute l’eau de l’échantillon (anhydre). Puis, on le dépose dans des bains de toluène (plus hydrophobe que l’alcool), qui va remplacer l’alcool et rendre le tissu translucide et pour finir de la paraffine fondue à 56°C qui va remplacer le toluène et solidifier l’échantillon.
Qu’est ce que le microtome ?
Un microtome est un “couteau”, un instrument utilisé en laboratoire pour couper des coupes très fines de tissus biologiques inclus dans de la paraffine, de la résine ou du glace (cryosection), afin de les observer au microscope optique ou électronique. Il est fixe alors que l’échantillon est mobile.
À quoi servent les fixateurs en microscopie ?
Les fixateurs empêchent la dégradation de l’échantillon et conservent la structure du tissu en stabilisant les protéines et empêchant l’autolyse des cellules.
Qu’est ce qu’un ultramicrotome ?
Un ultramicrotome est un type de microtome de haute précision, utilisé principalement en microscopie électronique en transmission (MET) pour obtenir des coupes ultrafines de l’ordre de 50 à 100 nanomètres (nm)
Comment prépare-t-on la coupe d’un échantillon pour l’ultramicrotome ?
L’échantillon est d’abord fixé au glutaraldéhyde (fixe les protéines et les structures cellulaires types organisés) puis au tétroxyde d’osmium (fixe les lipides des membranes, les mitochondries, réticulum endoplasmique, MP), avant d’être plongé dans des bains d’alcool de plus en plus concentrés, puis de l’oxyde de propylène et des résines de type epoxy (epon, durcupan). L’échantillon est pour finir solidifié dans un “four” puis coupé.
Qu’est ce que le cryodécapage ?
Le cryodécapage est une technique utilisée en microscopie électronique à transmission pour observer la structure interne des membranes biologiques et d’autres composants cellulaires en relief 3D.
Comment fait-on une préparation au cryodécapage ?
L’échantillon est d’abord congelé dans de l’azote liquide (évite la formation de cristaux de glace, qui pourraient endommager les structures cellulaires) puis fracturé grâce à une micro hache pour fragmenter les structures avant d’être soumis à décapage/sublimation (évaporation d’une fine couche d’eau sans passer par l’état liquide, augmente les contrastes, élimine les artefacts causés par la fracture), et pour finir est ombré et répliqué (recouvert d’un mélange de carbone et de platine pour former une réplique métallique).
Comment peut on améliorer les contrastes en photonique ?
Pour améliorer les contrastes et l’observation de l’échantillon on peut se servir des colorants usuels (approche empirique : technique que l’on juge strictement d’après le résultat), de la fluorescence (primaire : substances qui fluorescent naturellement - secondaire : substances qui doivent être colorées par les fluorochromes - immunofluorescence) ou de la cytoenzymologie. On peut aussi s’aider de l’autoradiographie et de techniques comme le microscope à champ sombre.
Qu’est ce que l’histocytochimie ?
C’est l’étude des raisons de la coloration (pourquoi un colorant colore-t-il une organelle différemment d’une autre ?)
Comment fonctionne le processus d’immunofluorescence ?
L’on se sert d’une réponse immunitaire pour montrer la présence d’anticorps par fluorescence. Par exemple, l’on extrait des microtubules d’un cerveau de bovin que l’on injecte dans un lapin (substance étrangère) auquel on fait une prise de sang (le lapin aura produit des anticorps contre la tubulaire de bovin, qu’on fait précipiter à l’aide de (NH4)2SO4). On purifie les anticorps par affinité et on y ajoute les fluorochromes. On traite la cellule avec ces anticorps puis on l’observe au microscope : mise en évidence des anticorps par immunofluorescence.
En quoi consiste la cytoentymologie ?
Cela consiste à utiliser une enzyme que l’on sait est présente dans l’échantillon pour marquer sa présence dans une organelle, structure.
