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BTTV yes > bttv yes > Flashcards

bttv yes Flashcards

1
Q

1.1. Welche grundsätzlichen Richtlinien gibt es, die einem die Entwicklung eines aufreinigungsprozesses erleichtern ?

A
  • die größte Anzahl zuerst entfernen
  • ausnutzen von Charakteristiken oder Seperationsgrundlagen mit dem größten Unterschied zwischen Produkt und Unreinheit.
  • ausnutzen von seperationsgrundlagen in aufeinanderfolgenden schritten
  • einfach halten
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2
Q

1.2. In welche 5 Abschnitte lässt sich ein aufarbeitungsverfagren unterteilen? Was ist die Hauptaufgabe dieser Abschnitte? Nenne je einen Prozess, den man den Abschnitten zuordnen kann.

A
  1. Fest-flüssig separation
    - separiert flüssig und fest Bestandteile
    - > filtration
    - > zentrifugation
  2. Isolation,Erfassung, Konzentrierung
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3
Q

1.3. Welches ist in der Regel die mengenmäßig größte ,kontaminante” in pharmazeutischen aufreinigungsprozessen?

A

Wasser mit normalerweise mehr als 80% da Zellen hauptsächlich aus Wasser Bestehen. Gefolgt von Protein (15%) und Kohlenhydrate 15% und fetten 15%

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4
Q

1.4. Warum ist die Reduzierung von der größten kontaminante essentiell für einen ökonomischen Prozess? 4 Gründe

A

Großes Volumen

  • bedeutet höhere Kosten beim filtern und auf reinigen
  • längerer Prozess -> kann dazu führen dass Produkt kaputt geht
  • längerer Prozess bedeutet auch höhere Kosten für Personal und Einrichtung
  • Grobe Filterung ist billiger als eine hochauflösung (sehr teuer)
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5
Q

1.5. Welche Verfahren kann man für die Reduzierung der kontaminante anwenden? Unterscheide zwischen intra und extra zellulären Produkten. Nenne je 2

A
  • Intra: Zelle muss aufgeschlossen werden, Zentrifugation oder Filtration
  • Extra: Produkt kann direkt aus Flüssigkeit gewonnen werden: ATPS, HGMS
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6
Q

1.6 welches sind die hauptanwendugsgebiete von insulin und Antikörpern?

A
  • Patienten mit Diabetis typ 1 und 2

- zur Krebstherapie

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7
Q

.7. Nenne ein weiteres biopharmazeutikum und sein Anwendungsgebiet

A

Humira für die Tumorbekämpfung

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8
Q

1.8. Wie Gros (kDA) sind jeweils Insulin und monoklonale Antikörper? Beschreibe den Aufbau

A

Insulin: 5,8 kDA
- 51 Aminosäuren aufgeteilt auf A-chain und B-chain

Antikörper: 2x 23 kDA + 2x(50-70) kDA
- zwei identische leichte ketten + zwei identische schwere ketten.

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9
Q

1.9. Aus welchen Materialien wurden die beiden biopharmazeutika ursprünglich extrahiert?
Welche Zellen werden heute hauptsächlich für die Produktion verwendet?

A

Insulin: wurde anfangs vom Hunde Bauchspeicheldrüsen dann vom Schwein -> näher am menschlichen Insulin
- heute e.coli

Anti-Bodys: wurde von Mäusen genommen und humanisiert heute werden weiße Blutkörperchen im Labor geklont.

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10
Q

1.10. Gibt es einen Zusammenhang zwischen Anzahl der für einen Prozess verwendeten Schritte und der potentiellen Ausbeute dieses Prozesses? Beschreibe und Skizze.

A

In jedem prozessschritt ist mit ein Produkt Verlust zu rechnen. Durch Oxidation, pH-Änderung, Temperatur-änderung, denaturierung und andere Faktoren. Deswegen sollte man sich sicher sein so wenig prozessschritte wie möglich zu machen und eine möglichst hohe ausbeutungsrate.

Skizze !

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11
Q

2.1. nenne 5 Unterschiede in den eigenschaften von Gram + und -

A

Gram positiv

  • zellwanddicke 20-80 nm
  • Schichten in zellwand: 1
  • teichoic acid in wall : +
  • fett und lipoprotein : 0-3%
  • Protein Gehalt: 0%
  • sensitiv to penicillin: +

Gram negativ

  • zellwanddicke 10 nm
  • Schichten in zellwand: 2
  • teichoic acid in wall : -
  • fett und lipoprotein: 58%
  • Protein Gehalt: 9%
  • sensitiv to penicillin : - (not as much )
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12
Q

2.2. Bei welcher zellwand wirken lysozym und penicillin lyrisch? Welcher Mechanismus steckt jeweils dahinter?

A

Gram +

Lysozyme Schneider das ß(1-4) Glucose band zwischen der NAG und NAM. Das führt zu rissen und die zellwand löst sich auf.

Penicillin greift Enzyme an die murein verbinden. Beim Wachstum lösen sich die Zellen auf da die Enzyme nicht mehr aktiv sind.

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13
Q

2.3. Welche zellwand beinhaltet lipolplysaccharide und warum müssen diese im Prozess entfernt werden?

A

In gram negativer zellwand

Lipopolysaccharide ( LPS) hat eine negative Ladung und reagiert bei Säugetieren toxisch. Frei LPS in Lösung toxisch.

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14
Q

2.4. Wie kann man Lipopolysaccharidschicht destabilisieren? Nenne den mechanismus.

A

ungiftig machen: mit Enzym (Alkalinphosphatase) spaltet die zwei Phosphatgruppen ab.

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15
Q

2.5. Skizziere und beschrifte den Aufbau einer gram + und - zellwand

A 
Aufbau
Positiv:
Murein Schicht
Periplasma
Plasmamembran
Zytroplasma
Negativ:
Äußere Membran
Mureinschicht
Periplasma
Plasmamembran
Zytroplasma
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16
Q

3.1. Die lyse von Zellen bei der Verwendung von untres Hall basiert auf dem Phänomen der kavitation. Was ist karitativen und in welcher anderen Aufschluss Art kommt diese ebenfalls vor?

A

Spontan Bildung von dampfblasen in schnell strömender Flüssigkeit.
Übersteigt der Druck der Flüssigkeit den Dampfdruck, so ziehen sich die dampfblaseb implosionsartig zusammen

Bei hochdruckhomogenisation

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17
Q

3.2. Nenne 5 Parameter mit denen man die Güte und Charakteristik eines Zellhomogenates beschreiben kann!

A 
Viskostät
Hydrophobizität
zellbruchstückgroße
Ladung
Proteingehalt
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18
Q

3.3. Warum kommt es beim zellaufschluss zu einer erhöhten viskosität? Wie kann dies verhindert werden?

A

Da die langkettige DNA (sonst im Zellkern gebündelt) frei wird.
-> enzymatisch: durch DNAse (spalten die DNA) kann man dem entgegen wirken.

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19
Q

3.4/5. Zellaufschluss

Die Unterteilung in die gängigen Gruppen. + 6 verfahren

A

Nicht mechanisch:

  • Auflösen: Enzyme, chemisch, physisch
  • Trocknung

Mechanisch:

  • feste Scherkräfte: mahlen, Aufprall
  • Flüssige Scherkräfte: Ultraschall, Turbulenzen
  • kavitation: gas expansion
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20
Q

3.6. Beschreib Funktion und Aufbau einer kugelmühle.

A

Funktion: In der Kugelmühle werden Kugeln( Mahlkörper) und Mahlgut bewegt -> stoße zwischen Mahlkörper/ Mahlkörper und Mahlkörper/Wand. führt zu Schlagbeanspruchung.
Aufbau: horizontal drehbar gelagerten kreiszylindrischen Mahlbecher. Im Mahlraum befinden sich meist Glas oder Zirkon Kugeln ung Gewinde welches den Stoff durch die Mühle transportiert.

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21
Q

3.7. Gebe vier prozessparameter an und beschreibe wie eine Änderung dieser den zellaufschluss beeinflusst (k faktor)
(kugelmühle?)

A

Aufschliessungs mechanismus:

  • für große Zellen: kugelmühle
  • für kleine Zellen: Ultraschall

Sell Typen:
- Größe Zellen brechen einfacher auf als kleine

Betriebsparameter

  • Größe der Apparatur
  • Drehzahl
  • Temperatur

Equipment design
- auf welche Art und weise die Kühlung erfolgt

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22
Q

3.8. Nenne 5 Prozessparameter! Wie beeinflusst deren Änderung die Aufschlusskonstante K?
Warum wird diese wie angegeben verändert?

A

Temperatur (bei genügend Kühlung kaum Einfluss, sonst Produktabbau)

Agitator Speed/Design (Einfluss auf übertragene Kraft, bzw, „Treffer“ pro Zeit -> höheres k für höheres v)

Feedrate (Aufenthalt und damit Trefferwahrscheinlichkeit kleiner für hohes q)

Anzahl/Gewicht der Beads (Höhere Anzahl -> höhere Trefferwahrscheinlichkeit, höheres Gewicht -> höherer Schaden)

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23
Q

3.9. Resuspensiomspuffer, lysepuffer, neutralitionspuffer: nenne die 5 wichtigen Bestandteile dieser Puffer und welchen Zweck sie bei einer alkalischen lyse haben.

A

Resus:

  • tris HCL
  • EDTA

Lyse:

  • NaOH
  • SDS - verseifung der zellwand

Neutral:

  • acetat
  • phosphate
  • Resuspensionspuffer führt zur Lyse
  • Lysepuffer sorgt für Proteinkomplexe und Denaturation der Nukleasen
  • Neutralisationspuffer sorgt für Renaturierung der pDNA
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24
Q

3.10. Nenne 4 verschieden Gruppen von chemischen Agentien die für den Zellaufschluss verwendet werden.

A
  • Chaotrope Mittel-> zunähme Entropie, zerstören Wasserbrücken.
  • Tenside
  • Lösungsmittel
  • Chelatbilder
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25
Q

3.11. Wie ist die Funktionsweise die den einzelnen Stoffgruppen zugesprochen wird? Nenne je ein Agens welches in die jeweilige Gruppe fällt

A
  • Chaotrope Mittel -> brechen die Wasserstoffbrückenbindung, Urea
  • Tenside -> verseifen die Lipide in der Zellwand, Natriumsulfat
  • Lösungsmittel ->Aufnahme durch die Zellwand, platzen, Ethanol
  • Chelatbilder -> EDTA setzt LPS frei
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26
Q

3.12. Nenne die Wirkungsweise der „French Press“! Welches ist der Hauptgrund, der bei der Anwendung der French Press zur Zelllyse führt?

A

Zylinder mit Nadelohröffnung-Ventil . Darin wird druck aufgebaut. Beim öffnen des Ventils durckdifferenz zieht flügkeit nach außen und die entstehenden Scherkräfte führen zu zellyse. Gas?

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27
Q

3.13. Wie funktioniert ein Hochdruckhomogenisator? Beschreibe!

A

Durch ein Ventil mit einem engen Spalt wird die Zelllösung gepresst. Danach treffen die Zellen zusätzlich auf einen Stahlring auf.

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28
Q

3.14. Hochdruckhomogenisator:
Welches sind die Mechanismen die zum Zellaufschluss führen?
nenne 4. Welche Prozessparameter haben einfluss auf die Aufschlussgüte

A
  • Kavitation
  • Dekompression
  • Turbulenzen
  • Aufprall zerstören die Zelle.

-Temperatur, Ventildesign, Druck, Flowrate, Zellenkonzentration

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29
Q

4.1. Durch welche Formel wird allgemein die Sinkgeschwindigkeit eines Partikels beschrieben? Gib für jeden Parameter der Formel einen für ein Zellhomogenat typischen Wert an! Gilt diese Formel für konzentrierte Suspensionen? Begründe!

A

Stokes Gleichung: v=(d^2)/(18µ) * (ps-pl)g
ps= 1-1.1 kg/L
pl=1 kg/L
d=0.2 - 100µm (Bakterium-Pflanze)
µ= Temperaturabhängig zwischen 0.2-1 mPa*s

Nein. da die Formel nur den einzelnen Partikel betrachtet. die Beeinflussung durch nachbarpartikel bei hoher Konzentration fließt nicht in die Berechnung mit ein. z.b. elektronische Anziehung oder Abstoßung

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30
Q

4.2. Erhöht oder erniedrigt eine hohe Konzentration von Feststoffteilchen die Absetzgeschwindigkeit im Vergleich zu niedrig konzentrierten Suspensionen?

A

absetzgeschwindigkeit wird erniedrigt, da die Nachbarpartikel beeinflussen. Die vorbei fließende Masse hindert den Nachbar Partikel am sedimentieren.

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31
Q

4.3. Um verschiedene Zentrifugentypen zu vergleichen wurde das Prinzip der äquivalenten Klärfläche eingeführt. Wie ist diese definiert? Gib die Formel an!

A

A ist die benötigte Fläche eines unter gravitation sedimentierenden Tankes mit der gleichen Klärkapazität wie eine Zentrifuge unter den selben Bedingungen. A=Q/v mit Vs,g

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32
Q

4.4. Wie funktioniert ein Tellerseperator? Nenne drei verschiedene Bau- und Funktionsarten

A

Die Flüssigkeit wird durch einen Stapel drehender Teller geleitet und so beschleunigt. Dadurch sammeln sich Feststoffe auf Grund ihrer Dichte nach außen und können gesammelt/abgetragen werden.

Die Bauarten unterscheiden sich vor allem im Einlass des Zentrifugats. Zudem gibt es Unterschiede ob Feststoffe gesammelt oder (semi-)kontinuierlich ausgetragen werden.

  • Konventionell
  • Hydro-Hermetic Feed Design
  • Accelerator Design
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33
Q

4.5. Wie funktioniert ein Dekanter? Erkläre anhand einer Skizze!

A

In einem drehenden Zylinder befindet sich eine (leicht) unterschiedlich Drehende Schnecke. Durch die Drehgeschwindigkeit werden Feststoffe nach ihrer Dichtenach außen getragen und durch die Schnecke nach hinten aus dem Pool über den Beach ausgetragen. Die geklärte Flüssigkeit wird am anderen Ende ausgeschieden. Die Poolhöhe kann am Auslass entsprechend eingestellt werden.

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34
Q

4.6. Nenne 4 Prozessparameter und wie sie die Fest-Flüssigtrennung im Dekanter beeinflussen.

A

Geschwindigkeitsdifferenz: Sie legt die Verweildauer im Dekanter fest

Pooltiefe: legt fest, wie tief der Pool ist und hat Einfluss auf die Restfeuchte im abgetrennten Kuchen.

Rotationsgeschwindigkeit: Je schneller, desto bessere Abtrennung

Feedrate: Je langsamer, desto länger der Aufenthalt im Dekanter, aber auch längere Prozessdauer

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35
Q

4.7. Inchlusion bodies und Zellwand haben ungefähr die gleiche Dichte, was kann man machen um sie trotzdem in der Zentrifuge zu trennen?

A

die mistverwendeten Methoden ist:

  • mechanische oder chemische aufbrechen der Zellwand
  • anschließend wird das Gemisch zentrifugiert um die dichteren Inclusion bodies von den wesentlich leichteren Zellwand Stücken zu trennen.
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36
Q

4.8. Zeichne in einem Diagramm den Verlauf der Abtrennung der Zellbruchsgtücke und Etrag der Inclusion bodies über die Flussgeschwindigkeit der Zentrifuge.

A

->Jakob

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37
Q

4.9. Wie ist die Zentrifugalbeschleunigung definiert? Gib die Formel und Einheiten der Parameter an!

A 
G= v^2 / R (m/s^2)
v= tangentiale Geschwindigkeit (m/s)
r= Radius (m)
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38
Q

4.10. Durch welche Maßnahmen kann man die Scherbelastung in einer Tellerzentrifuge minimieren?

A
  • Platteneinlass: wird durch die Achse gefüllt. -> übergangslose Zuführung des Stoffes. keine Luft-Flüssig Schnittstelle.
  • Hermetischer Einlass: Der Feed wird durch den Boden zugeführt vor eintritt durch Verteiler beschleunigt.
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39
Q

4.11. Nenne 3 verschiedene Bauarten/Designs von Zentrifugen.

A
  • Tellerzentrifuge
  • tubular Bowle
  • decanter
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40
Q

4.12. Wie ist der Sigma-Faktor definiert (beschreibender Text) und welche Formel ergibt sich dadurch für die volumetrische Flussrate?

A

Sigma (äquivalente Klärfläche) ist die benötigte Fläche eines unter gravitation sedimentierenden Tankes mit der gleichen Klärkapazität wie eine Zentrifuge unter den selben Bedingungen.
Q = Vs, g * Sigma

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41
Q

4.13. Nenne 2 Methoden oder biologische Modelle um die Scherbelastung in einer Zentrifuge zu dokumentieren!

A

1 - säugetierzellen sind sehr empfindlich und können so gut als Probezelle verwendet werden. Belastung kann durch Konzentration der DNA nach der zentrifugartion gemessen werden.
2 - gelelektrophogenese - Zentrifugieren mit plasmid DNA und anschließend wird geschaut wie viel davon denaturiert/aufgebrochen wurde.

42
Q

5.1. Wie funktioniert ein Tiefenfilter? Nenne die 3 wichtigsten Abscheidemechanismen moderner Tiefenfilter!

A

Der Tiefenfilter wird oft als Vorfilter verwendet, um bei der finalen Filtration möglichst wenig Reststoffe zu haben und größere Bestandteile der Lösung vorher auszufiltern. Er besteht aus einer dicken, porösen Matrix. Die Ausbildung eines Filterkuchens ist, im Vergleich zum Oberflächenfilter, ausdrücklich nicht erwünscht.

  1. Sedimentation
  2. Diffusion
  3. Sperreffekt
  • Zusätzlich kann durch elektrostatische Ladung des Filtermediums ein Rückhalt von geladenen Partikeln erfolgen.
  • In der Regel wird der Filter durch Amine positiv geladen.
  • oberflächenzurückhaltung
  • tiefen absiebung (in den Poren werden Partikel durch die verwundene Struktur des Filters abgeschieden)
43
Q

5.2. Wie funktioniert Querstromfiltration? Nenne 5 Mechanismen die zu einem Filterwiderstand führen!

A

eine pumpe wird verwendet um einen Kanal zwischen zwei oberflächen gepumpen. Bei jedem überfließen der Oberfläche, drückt die aufgebrachte Kraft einen Teil des Fluids durch die Membran in den Filtratstrom.

  • Membranwiderstand
  • Porenadsorptionswiderstand
  • Porensperrwiderstand
  • Konzentrationspolarisationswiderstand
  • Gel- oder Kuchenbeständichgkeit
44
Q

5.3. Welche Suspensionseigenschaften führen bei der Oberflächenfiltration von biologischem Material zu einer Verblockung des Filters? Welche Filterhilfsmittel können dies Verhindern und wie wirken diese?

A

Biologisches Material ist weich, klebrig, wässrig und verformbar.

Durch Bildung eines undurchlässigen Kuchens kann so der Filter verstopfen.

Als Filterhilfsmittel können Perlite und Kieselgur benutzt werden. Diese erhöhen die Porosität des Filterkuchens und so die Filtereffizienz.

45
Q

5.4. Zeichne eine typische TFF Anlage. Wie kann man die Deckschichtbildung verhinder? Nenne 3 Möglichkeiten

A
  • Turbulenten Strom zu erzeugen: Anlegen eines Pulses im Feed oder anbringen von Screens
  • Rückmischung von Feststoffen erleichtern: kurze, enge Fließwege oder Temperaturerhöhung
  • Druck vermindern oder Feststoffanteil in der Lösung absenken
46
Q

5.5. Was ist ein Sterilfilter und wie ist gegenwärtig die Porengröße die von den Herstellern angegeben wird / werden muss.

A

Ein Sterilfilter ist ein Filter mit kleinstmöglichen Poren, die kleinste Organismen ausfiltern können. Angegeben wird 0.2/0.22 Sterilfilter, auch wenn sich die Eigenschaften der Filter verschiedener Hersteller stark unterscheiden können. Ausschlaggebend ist ein Rückhalt von mindestens 1*10^7 KBE B. diminuta pro cm² EFA

47
Q

5.6. Wie ist der Druckabfall über einen Filter definiert? Formel!

A

Darcy

48
Q

5.7. Steigt oder sinkt deltaP mit zunehmender Kompressibilität biologischer Prozesslösungen?

A

Sie wird niedriger. Da der Druck durch kopressibilitärt ausgeglichen wird

49
Q

5.8. Wie kann die Filtrierbarkeit kompressibler Filterkuchen erhöht werden?

A

Filterhilfsmittel:

  • Diatomeenerde
  • Periliten
50
Q

5.9. Sind Tiefenfilter in der Regel positiv oder negativ geladen? Welche Kontaminante wird hier speziell adressiert? Gibt es eine grundsätzliche Überlegung bei welchem pH der Filtrationsprozess gefahren werden sollte?

A

sie sind in der Regel positiv geladen um negativ geladene Kontaminanten zu entfernen.

  • zellbruchstücke
  • nucleinsäuren
  • Aggregate von wirtzzellen

Je nachdem wo der PI desProduktprotein und des Wirtsproteins liegt.

51
Q

5.10. Wie funtioniert eine UF/DF Anlage zur Konzentrierung und Puffertausch von Prozesslösungen? Skizziere und beschreibe!

A

Frage 2 Mathias.

52
Q

5.11. Das Produkt hat einen PI von 8, die Wirtsproteine von 5 und DNA von 2. Bei welchem PH würde man einen Tiefenfilter betreiben und wie ist er in der Regel geladen?

A

zwischen pH 5-8.

Tiefenfilter sind in der Regen positiv geladen

53
Q

6.1. Welches ist der grundlegende Unterschied zwischen Expanded Bed Adsorption und Chromatografie in gepackten Betten? Welcher Vorteil ergibt sich daraus für EBA? Wie sieht der typische Prozessablauf eines EBA Prozesses aus?

A

Im gepackten Bett gibt es keine Möglichkeit für größere Moleküle, wie Zellbruchstücke und DNA-Moleküle etc., abzufließen. Sie verstopfen das Bett. Um das zu vermeiden müsste vorher Filtriert oder Zentrifugiert werden. Dies erhöht die Prozessdauer und -kosten.

Zusätzlich nutzt EBA unterschiedliche Größen und Dichten der Adsorber aus, um so Loops zu erzeugen.

1) Sedimentierte Adsorber
2) Durch flüssigkeit expandiert
3) Eingabe der lösung
4) Waschen
5) Durch kolben packen und auswaschen
6) Reinigen und regenerieren

54
Q

6.2. Welche Eigenschaften der Adsorber führen zu einem stabilen Bett? Welche grundlegende Formel beschreibt die Abhängigkeiten, gib an.

A

Stokes: sinkgeschwindigkeit = auftriebgeschwindigkeit

  • Durchmesser.
  • schwerer Kern
  • von unten nach oben ändernde Bedingungen unten große Dichte großer Durchmesser
  • > jeder absorber hat seinen Platz.
55
Q

6.3. Nenne vier Methoden mit denen Biomasse-Adsorberinteraktionen gemessen werden können. Wie funktioniert diese, erläutre kurz.

A

1) Finite bath: Beobachtung der elektrischen Leitfähigkeit einer Lösung mit Adsorbern. Bei Interaktionen nimmt die Leitfähigkeit ab
2) Impulsantwort: Der Zellübertragungs Index wird vor und nach der Säule durch Messung der OD600 bestimmt und ausgewertet.
3) Zeta-Potential: Das Zeta-Potential der Adsorber wird gemessen und eine Probe der Biomasse eingebracht. Ändert sich nun das Potential, so deutet das auf eine Wechselwirkung hin. Durch Korrelation zeigt sich: ein CTI von weniger als 120 ist am besten.
4) Verweilzeitverteilung: Ein Puls durch die Säule wird vermessen. Aus dem Graphen der Pulsantwort können Rückschlüsse gezogen werden wie: Rückflüsse, Channeling, interne Rezirkulation.

56
Q

6.4. Beschreibe den Ablauf/ notwendige Versuche für eine gerichtete Prozessentwicklung von EBA Verfahren.

A

1) Untersuchung der Aufnahmekapazität und der Kinetik des Adsorbers (Finite Bath)
2) Messung der Biomasse-Adsorber Interaktionen (Finite Bath 10min->C/Co<0.1 bzw. Pulse Response CTI>0.9)
3) Überprüfen der Stabilität des Bettes (RTD-PDE Model)
4) Vergrößerung des Bettes

57
Q

6.5. Welches ist der grundlegende Unterschied von EBA und traditionellen fluidisierten Betten in der chemischen Industrie. Wie wurde dies erreicht? erläutere!

A

-Verbesserung der durchflussgeschwindigkeit und Verhinderung der adsorbermischung durch dichtere kerne und Schichten von adsorbent mit verschiedenen eingenschaften(d,p)

58
Q

6.9. Beschreibe den aufbau und die Funktionsweise von EBA. Warum spricht man von einem stabilen Bett?

A

Negative Eigenschaften des fluidized beds werden in der EBA ausgeglichen. Dazu gehört vor allem die Rückmischung und die Erhöhung der Fließgeschwindigkeiten.

Dies geschieht durch die verschiedenen Dichtezonen im Bett.

59
Q

6.10. Für die Prozessierung von zellhaltigen Prozesslösungen werden in der Regel Kationentauscher verwendet. Warum und warum funktionieren Anionentauscher in der Regel nicht unter diesen Bedingungen?

A

Bei Arbeiten um den neutralen pH wert giibt es grundsätzlich eine Interaktion zwischen Biomasse und Anionentauscher. Diese ist jedoch unerwünscht, da eigentlich eine Bindung des Produkts stattfinden soll, welches hier noch positiv geladen ist. Deswegen muss mit einem Kationentauscher gearbeitet werden.

60
Q

6.11. Was wird durch Verweilzeitmessungen bei der Auslegung von EBA Prozessen bestimmt? Beschreibe die Durchführung.

A

Durchbruch Tunnel Rückfluss dirchmischung

61
Q

6.12. Wie bestimmt man die Bindekapazität einer EBA Säule?

A

Finite bath
Gleiche konzentration adsorber + Protein verschiedene konz. -> nach ca10 min. Protein/adsorber herausfinden und auftaten.

62
Q

7.1. skizziere und beschrifte ein typisches Zweiphasensystem mit den wichtigsten Parametern! Wie sind folgende Parameter definiert: Binodale, Konode, Verteilungskoeffizient, Volumenverhältnis der Phasen.

A

https://de.wikipedia.org/wiki/Datei:Spinodale_und_Binodale.svg

  • Binodale ist die Kurve eine einem phasendiagramm ab welcher ein Phasenübergang stattfindet.
  • Konode bezeichnet die Linie welche die beiden Zustandspunkte die im Phasengleichgewicht stehende miteinander verbindet.(gleiche Phaseneigenschaft)
  • Verteilungskoeffizient gibt an, wie sich ein Stoff zwischen zwei nicht-mischbaren Phasen verteilt.(D= Co/Cu)
  • Volumenverhältnis gibt das Verhältnis der Volumina zweier betrachteter Mischungskomponenten zueinander an. -> Vi/Vj
63
Q

7.3. Skizziere ein Fließbild für eine Anlage zur Magnetseparation. Erkläre anhand der Skizze den Prozessverlauf einer magentischen Aufarbeitung.

A

VL 7 Folie 40?

64
Q

7.4. Warum liegt die Ausbeute in der Regel für Magnetseparation unter der von Expanded Bed Adsorption. Begründe.

A

Die Bindungsoberfläche durch die Spacer und Liganden ist viel geringer als bei EBA.

65
Q

7.5. a) Skizziere und beschrifte ein Phasendiagramm für ein typisches ATPS mit den wichtigsten Parametern! c) Wie kann das Volumenverhältnis der beiden Phasen aus dem Phasen diagram bestimmt werden?

A

L1/L2=V2/V1

66
Q

7.6. a) Skizziere und beschrifte ein Phasendiagramm für ein PEG-Phosphat

A

VL 06 Folie 11

67
Q

7.7. Das Produkt verteilt sich für ein gewähltes Phasensystem in die Oberphase. Wie kann es daraus sinnvoll gewonnen werden?

A

Noch mal atps in untere Phase bekommen

68
Q

7.9. Welchen Vorteil würde eine Kombination von Expanded Bed Adsorption und Zweiphasensystemen bringen? Begründe!

A

?

69
Q

7.10. Wie funktioniert Magnetseparation? Beschreibe einen typischen Prozessablauf.

A

Die magnetic beads werden in die Prozesslösung gebgeben. Diese wird anschließend durch einen Magnetisierten Filter gepumpt. Die beads bleiben hängen. Nach abschalten des Magnetfeldes können die beads aufgereinigt werden und das Produkt gewonnen.

70
Q

7.11. Welches ist prozesstechnisch gesehen der signifikante Unterschied zwischen EBA und Magnetseperation?

A

Die Anlagengröße. State of Art bei HMGS sind 1L Anlagen < als EBA

71
Q

7.12. Erfolgt die Proteintrennung aufgrund des Magnetfeldes?

A

Die Adsorber werden durch das Magnetfeld getrennt. allerdings sind die Proteine an den Absorber gebunden und werden durch das Magnetfeld indirekt getrennt.

72
Q

7.13. Welches ist der Hauptvorteil der Magnetseparation?

A

Spezifische Bindemöglichkeit durch Liganden und dadurch hochreini Abtrennung aus der Prozesslösung

73
Q

7.14. Das Produkt verteilt sich für ein gewähltes Phasensystem in die Unterphase. Wie kann es daraus sinnvoll gewonnen werden?

A

?

74
Q

7.15. Wie könnte eine Gegenstromapparatur für ATPs aussehen? Skizziere und beschreibe!

A

?

75
Q

7.16. Verdünnt oder konzentriert ein ATPS das Produkt… Begründe!!!

A

es verdünnt.

76
Q

8.1. Skizziere ein typisches Zweiphasendiagramm.

A

?

77
Q

8.2. Wie ist das Volumenverhältnis der beiden Phasen in Abhängigkeit zum Mischungspunkt im Phasendiagram definiert. Gib die Formel an.

A

L1/L2=V2/V1, ausgehend vom Mischungspunkt die Restlänge L der Konode zum jeweiligen Binodalenende

78
Q

8.3. Das Produkt verteilt sich in die Unterphase. Wo muss der Mischungs- Prozesspunkt auf der Konode liegen um A) eine maximale Ausbeute und B) eine maximale Konzentration der Unterphase zu erlangen

A

A) Maximale Ausbeute, wenn Volumen2 möglichst groß -> kurze Länge L2

B) Volumen 2 möglichst klein, daher möglichst kurze Länge L1

79
Q

8.4. Beschreibe eine Apparatur die man zur Prozessierung/ Trennung eines wässrigen Zweiphasensystems benutzen kann

A

7.4. Jakob

80
Q

9.1. Welches sind die wichtigsten Chromatografiarten in der biopharmazeutischen Industrie. Nenne 5

A
  • Gelfiltration - Größe
  • Hydrophobe Interaktions Chromatografie
  • Ionenaustausch
  • Liganten Affinität
  • Reversed Phase (unpolare stationäre Phase, polare mobile Phase)
  • SEC
  • IEX
  • HIC
  • RP
  • MM
  • AF
81
Q

9.3. Nenne eine sinnvolle Kombination von 3 Chromatographieschritten und erläutere warum diese gewählt wurde?

A

Bsp.: 1) Ionenaustausch (IEX)

  • Ausnutzung der (schwachen) ionischen Eigenschaften und Konzentrierung großer Volumina möglich
    2) Hydrophobic Interacion (HIC)
  • Durch Salze kann die hydrophobe WW von Proteinen gesteigert werden, beim eluieren aus der Säule wird die Salzkonzentration gesenkt, Proteine unterschiedlicher Hydrophobizität werden nacheinander ausgespült.
    3) Gelfiltration (GF)
  • Verschiedene Proteine können nun durch ihre Größe getrennt werden. GF ist besonders bei kleinen Probevolumina geeignet und kann die Konzentration zudem verdünnen.
82
Q

9.4. Wie funktioniert Größenausschlusschromatographie? Wie ist der Verteilungskoeffizient definiert? Skizziere eine typische Kallibrationsgerad die die Trennung verschieden großer Proteine beschreibt.

A
  • Die Lösung wird in ein packed bed gegeben. Meist wird eine Agarose-gelmatrix mit sehr hohem Wasseranteil genutzt. Die Partikel in der Lösung gehen dabei keine direkte Wechselwirkung mit der Matrix ein. Allerdings ergeben sich durch die unterschiedliche Größe der Stoffe unterschiedliche Bewegungsmöglichkeiten durch die Matrix, so das große Partikel früh und kleine erst später eluiert werden.
  • Kav=(Vemax-Vzwischrenraum)/(Vtotal-Vzwischenraum) sollte immer zwischen 0 - 1 liegen (Vemax=Vzwischenraum+Vpore)
  • > Jakob
83
Q

9.7. Ziel ist es Produkt A möglichst gut von den kontaminierenden Zellproteinen zu trennen. Produkt A hat einen pl von 3.0, die kontaminierenden Zellproteine sind durch einem pl zwischen 5-7 charakterisiert. Welche Chromatographieart würden sie wählen wenn das Produkt sehr verdünnt vorliegt. / das Produkt sehr instabil ist? Warum

A
  • verdünnt: anionentauscher pH 3-5 Produkt bindet

- Instabil: kationentauscher 3-5 Protein bindet -produkt kommt nicht mit Oberflächen in Verbindung

84
Q

9.10. Erkläre den grundsätzlichen Unterschied zwischen HIC und RP

A

Bei RP wird eine stark hydrophobe LIgandenfläche allmählich mit einem organischen Lösungsmittel neutralisiert. Je nach Hydrophobizität werden so die einzelnen Stoffe getrennt.

HIC hingegen erhöht die Salzkonzentration um eine Erhöhung der Hydrophobizität des Materials zu ermöglichen.

85
Q

9.11. Wie sind Effizienz, Selektivität und Auflösung (Resolution) definiert. Skizziere für jeden Parameter.

A

Effizienz: Wie schmal ist der Peak, also wie dicht zusammen werden gleiche Stoffe beim Chromatographieren eluiert.

Selektivität: Wie weit liegen die Peaks auseinander? Wie gut werden unterschiedliche Stoffe getrennt.

Auflösung: Selektivität/Effizienz

86
Q

9.12. Zeichne den van Deemter Plot und gib die Formel an.

A

H(u)=A+B/u+Cu

A=Eddy-Diffusion, linear und unabhängig von u

B=Längsdiffusion: je höher u, desto geringer der Einfluss

C=Massentransfer, je höher u, desto mehr Masse kann transferiert werden.

87
Q

9.15. Nenne eine typische Kombination von Chromatographieschritten für die Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern.

A
  • AF affinitätschromatographie (protein a capture) (hohe kosten, 95% rein)
  • IEX ionenaustauschchromatographie
  • HIC hydrophobe interaktionschromatographie
88
Q

9.16. Nenne drei unterschiedliche Aufbauten von Adsorbermaterialien! Welche Vor und Nachteile bieten diese?

A
  • Monolithic column: lange und dünne Säulen, keine Limitationen durch Diffusion aber nur geringe Kapazität
  • Packed Column: Mischung aus porösem und nicht porösem Material, geeigent für analytische sowie präparative Chromatographie
  • Membrane Stack: keine Limitationen durch Diffusion, hohe Kapazitäten, geringer Gegendruck
89
Q

9.17. Skizziere eine typische Adsorptionsisotherme und eine Adsorptionskinetik

A

-> Jakob

90
Q

9.18. Wie ist das experimentelle Vorgehen bei der Bestimmung von lsotherme und Kinetik!

A

Isotherme: Mehrere Proben mit gleicher Menge Adsorbermaterial werden für einige Stunden mit verschiedenen Konzentrationen an Proteinen gemischt, um so den Quotient Protein/Adsorber zu bestimmen.

Kinetik: Gleiche Menge an Adsorber und gleiche Konzentration an Proteinen werden in mehreren Messreihen zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Das verbleibende freie Protein wird gegenüber der Zeit aufgetragen.

91
Q

9.19. Wie ist der HETP Wert definiert? Gib die Formel an und Beschreibe!

A

Height of a theoretical Plate. HETP=L/N mit Säulenlänge L und berechnetem N aus der Effizienz der Säule
(𝑁=16(𝑡𝑟/𝑤𝑏)²=5.545(𝑡𝑟/𝑤ℎ)²)

Je besser die Effizienz, desto größer wird N.

Wb=Breite des peaks an der Basis, wh=Breite des Peaks in der Hälfte

92
Q

9.20. Welche Einteilung von Salzen gibt es die ihre Wirkung bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie beschreibt. Nenne beide Gruppen und je ein typisches Salz dieser Gruppen.

A

Kosmotrope (wirken stabilisierend): K2SO4

Chaotrope: (destabilisieren): KSCN

93
Q

9.22. Warum verwendet man Size Exclusion Chromatography (SEC) in der Regel am Ende eines Prozesses und nicht am Anfang?

A

Muss in der Regel im Batchbetreib gefahren werden, und kann nur kleine Probevolumina verarbeiten.

94
Q

9.23. Beschreibe den Prozess des Umpufferns mittels SEC…alle Prozessschritte angeben.

A

Die Säule wird mit dem neuen Puffer durchspült und gefüllt. Auf diesen wird dann die Probe gegeben. Die Partikel der Probe sind größer als die Moleküle des oberen Puffers. Sie gehen also schneller durch die Säule und kommen am Ende im mit dem neuen Puffer aus der Säule.

95
Q

9.24. Warum binden Proteine an hydrophobe Oberflächen? Thermodynamische Erklärung!

A

Die Hydrophoben Flächen der Proteine und der Liganden werden von einer geordeneten Wasserschicht umgegeben. Um die Entropie zu erhöhen, muss die maximale Fläche dieser geordneten „Schalen“ reduziert werden. Die Proteine lagern sich an die Liganden.

96
Q

9.25. Nenne drei typische HIC Liganden

A

Phenyl, Butyl, Ether

97
Q

9.26. Warum wird Ionentauscher Chromatographie gerne mit hydrophober lnteraktionschromatographie kombiniert? In welcher Reihenfolge (Begründe)?

A

IEX->HIC.

  • Für das Ablösen der gebundenen Stoffe wird der Salzgehalt erhöht. Dieser kann in der HIC genutzt werden da hier mit hohem Salzgehalt begonnen und dann gesenkt wird.
  • Im Ioneneaustauscher wird die Prozesslösung gereinigt. So passieren weniger Nebenraktionen beim HIC
98
Q

9.27. Was ist Affinitätschromatographie? Nenne 4 Ligand-Produktpaare in der Affinitätschromatographie

A

Affinitätschromatographie nutzt die spezifischen WW zwischen Biomolekülen und Liganden aus. Durch Änderung der Konditionen (pH…) kann diese Bindung wieder gelöst werden. Dadurch können große Volumina bearbeitet und stark aufkonzentriert werden.

Protein A: Fc region of IgG

Protein G: Fc region of IgG

Cibacron Blue: Broad range of enzymes, serum albumin

Procion Red: NADP+ dependent enzymes

Lysine: Plasminogen, ribosomal RNA

99
Q

9.28. Wie wird In der Regel bei Affinitätschromatographie eluiert? Begründe!

A

Eluiert = Abtrennung des Produkts

  1. Änderung der pufferzusammensetzung welche die Bindung aufbricht ohne das Produkt oder Ligand zu beschädigen.
  2. extreme pH Änderung oder hohe konzentration von chaotrophen Stoffe.
    Kann zu temporäre oder langfristigen Schäden führen.
  3. spezifische Substanzen werden zugegen die in besserer Konkurrenz zum Liganden oder Produkt stehen. -> fast unmöglich auszureinigen
100
Q

9.29. Nenne typische Eigenschaften der Anfangsund Endbedinguengen von „_ Prozesslösungen für die vier wichtigsten Chromatographiearten.

A

GF: kleines Volumen -> verdünnte Probe. Pufferänderung
IEX: niedrige ionische Kräfte(wenig Salz) -> hohe ionische Kräfte. pH Änderung
HIC: hohe ionische Kräfte-> niedrige ionische Kräfte
AC: spezifische bindungs Bedingungen-> spezifische ablöse Bedingungen

101
Q

9.32. Welche Chromatographieart wird in der Regel verwendet um DNA abzureichern. Bei welchem pH wird der Prozess gefahren?

A

Anionentauscher

PH größer als 2 und kleiner als der pi der kontaminanten (wirtszellen etc)

102
Q

9.33.Man kann unter bestimmten Bedingungen die Beladung einer Chromatographiesäule deutlich erhöhen wenn vor der Beladung die Prozesslösung auf konzentriert wird. Unter welchen Bedingungen funktioniert dies, unter welchen nicht? Begründe!

A

?

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