BTTV 1-3 Flashcards
1.1. Welche grundsätzlichen Richtlinien gibt es, die einem die Entwicklung eines aufreinigungsprozesses erleichtern ?
- die größte Anzahl zuerst entfernen
- ausnutzen von Charakteristiken oder Seperationsgrundlagen mit dem größten Unterschied zwischen Produkt und Unreinheit.
- ausnutzen von seperationsgrundlagen in aufeinanderfolgenden schritten
- einfach halten
1.2. In welche 5 Abschnitte lässt sich ein aufarbeitungsverfagren unterteilen? Was ist die Hauptaufgabe dieser Abschnitte? Nenne je einen Prozess, den man den Abschnitten zuordnen kann.
- Fest-flüssig separation
- separiert flüssig und fest Bestandteile
- > filtration
- > zentrifugation - Isolation,Erfassung, Konzentrierung
1.3. Welches ist in der Regel die mengenmäßig größte ,kontaminante” in pharmazeutischen aufreinigungsprozessen?
Wasser mit normalerweise mehr als 80% da Zellen hauptsächlich aus Wasser Bestehen. Gefolgt von Protein (15%) und Kohlenhydrate 15% und fetten 15%
1.4. Warum ist die Reduzierung von der größten kontaminante essentiell für einen ökonomischen Prozess? 4 Gründe
Großes Volumen
- bedeutet höhere Kosten beim filtern und auf reinigen
- längerer Prozess -> kann dazu führen dass Produkt kaputt geht
- längerer Prozess bedeutet auch höhere Kosten für Personal und Einrichtung
- Grobe Filterung ist billiger als eine hochauflösung (sehr teuer)
1.5. Welche Verfahren kann man für die Reduzierung der kontaminante anwenden? Unterscheide zwischen intra und extra zellulären Produkten. Nenne je 2
- Intra: Zelle muss aufgeschlossen werden, Zentrifugation oder Filtration
- Extra: Produkt kann direkt aus Flüssigkeit gewonnen werden: ATPS, HGMS
1.6 welches sind die hauptanwendugsgebiete von insulin und Antikörpern?
- Patienten mit Diabetis typ 1 und 2
- zur Krebstherapie
1.7. Nenne ein weiteres biopharmazeutikum und sein Anwendungsgebiet
-Humira für die Tumorbekämpfung
1.8. Wie Gros (kDA) sind jeweils Insulin und monoklonale Antikörper? Beschreibe den Aufbau
Insulin: 5,8 kDA
- 51 Aminosäuren aufgeteilt auf A-chain und B-chain
Antikörper: 2x 23 kDA + 2x(50-70) kDA
- zwei identische leichte ketten + zwei identische schwere ketten.
1.9. Aus welchen Materialien wurden die beiden biopharmazeutika ursprünglich extrahiert?
Welche Zellen werden heute hauptsächlich für die Produktion verwendet?
Insulin: wurde anfangs vom Hunde Bauchspeicheldrüsen dann vom Schwein -> näher am menschlichen Insulin
- heute e.coli
Anti-Bodys: wurde von Mäusen genommen und humanisiert heute werden weiße Blutkörperchen im Labor geklont.
1.10. Gibt es einen Zusammenhang zwischen Anzahl der für einen Prozess verwendeten Schritte und der potentiellen Ausbeute dieses Prozesses? Beschreibe und Skizze.
In jedem prozessschritt ist mit ein Produkt Verlust zu rechnen. Durch Oxidation, pH-Änderung, Temperatur-änderung, denaturierung und andere Faktoren. Deswegen sollte man sich sicher sein so wenig prozessschritte wie möglich zu machen und eine möglichst hohe ausbeutungsrate.
Skizze !
2.1. nenne 5 Unterschiede in den eigenschaften von Gram + und -
Gram positiv
- zellwanddicke 20-80 nm
- Schichten in zellwand: 1
- teichoic acid in wall : +
- fett und lipoprotein : 0-3%
- Protein Gehalt: 0%
- sensitiv to penicillin: +
Gram negativ
- zellwanddicke 10 nm
- Schichten in zellwand: 2
- teichoic acid in wall : -
- fett und lipoprotein: 58%
- Protein Gehalt: 9%
- sensitiv to penicillin : - (not as much )
2.2. Bei welcher zellwand wirken lysozym und penicillin lyrisch? Welcher Mechanismus steckt jeweils dahinter?
Gram +
Lysozyme Schneider das ß(1-4) Glucose band zwischen der NAG und NAM. Das führt zu rissen und die zellwand löst sich auf.
Penicillin greift Enzyme an die murein verbinden. Beim Wachstum lösen sich die Zellen auf da die Enzyme nicht mehr aktiv sind.
2.3. Welche zellwand beinhaltet lipolplysaccharide und warum müssen diese im Prozess entfernt werden?
In gram negativer zellwand
Lipopolysaccharide ( LPS) hat eine negative Ladung und reagiert bei Säugetieren toxisch. Frei LPS in Lösung toxisch.
2.4. Wie kann man Lipopolysaccharidschicht destabilisieren? Nenne den mechanismus.
ungiftig machen: mit Enzym (Alkalinphosphatase) spaltet die zwei Phosphatgruppen ab.
2.5. Skizziere und beschrifte den Aufbau einer gram + und - zellwand
Aufbau Positiv: Murein Schicht Periplasma Plasmamembran Zytroplasma
Negativ: Äußere Membran Mureinschicht Periplasma Plasmamembran Zytroplasma
3.1. Die lyse von Zellen bei der Verwendung von untres Hall basiert auf dem Phänomen der kavitation. Was ist karitativen und in welcher anderen Aufschluss Art kommt diese ebenfalls vor?
Spontan Bildung von dampfblasen in schnell strömender Flüssigkeit.
Übersteigt der Druck der Flüssigkeit den Dampfdruck, so ziehen sich die dampfblaseb implosionsartig zusammen
Bei hochdruckhomogenisation
French press
3.2. Nenne 5 Parameter mit denen man die Güte und Charakteristik eines Zellhomogenates beschreiben kann!
Viskostät Hydrophobizität zellbruchstückgroße Ladung Proteingehalt
3.3. Warum kommt es beim zellaufschluss zu einer erhöhten viskosität? Wie kann dies verhindert werden?
Da die langkettige DNA (sonst im Zellkern gebündelt) frei wird.
-> enzymatisch: durch DNAse (spalten die DNA) kann man dem entgegen wirken.
3.4/5. Zellaufschluss
Die Unterteilung in die gängigen Gruppen. + 6 verfahren
Nicht mechanisch:
- Auflösen: Enzyme, chemisch, physisch
- Trocknung
Mechanisch:
- feste Scherkräfte: mahlen, Aufprall
- Flüssige Scherkräfte: Ultraschall, Turbulenzen
- kavitation: gas expansion
3.6. Beschreib Funktion und Aufbau einer kugelmühle.
Funktion: In der Kugelmühle werden Kugeln( Mahlkörper) und Mahlgut bewegt -> stoße zwischen Mahlkörper/ Mahlkörper und Mahlkörper/Wand. führt zu Schlagbeanspruchung.
Aufbau: horizontal drehbar gelagerten kreiszylindrischen Mahlbecher. Im Mahlraum befinden sich meist Glas oder Zirkon Kugeln ung Gewinde welches den Stoff durch die Mühle transportiert.
3.7. Gebe vier prozessparameter an und beschreibe wie eine Änderung dieser den zellaufschluss beeinflusst
Aufschliessungs mechanismus:
- für große Zellen: kugelmühle
- für kleine Zellen: Ultraschall
Sell Typen:
- Größe Zellen brechen einfacher auf als kleine
Betriebsparameter
- Größe der Apparatur
- Drehzahl
- Temperatur
Equipment design
- auf welche Art und weise die Kühlung erfolgt
3.8. Nenne 5 Prozessparameter! Wie beeinflusst deren Änderung die Aufschlusskonstante K?
Warum wird diese wie angegeben verändert?
Temperatur (bei genügend Kühlung kaum Einfluss, sonst Produktabbau)
Agitator Speed/Design (Einfluss auf übertragene Kraft, bzw, „Treffer“ pro Zeit -> höheres k für höheres v)
Feedrate (Aufenthalt und damit Trefferwahrscheinlichkeit kleiner für hohes q)
Anzahl/Gewicht der Beads (Höhere Anzahl -> höhere Trefferwahrscheinlichkeit, höheres Gewicht -> höherer Schaden)
3.9. Resuspensiomspuffer, lysepuffer, neutralitionspuffer: nenne die 5 wichtigen Bestandteile dieser Puffer und welchen Zweck sie bei einer alkalischen lyse haben.
Resus:
- tris HCL
- EDTA
Lyse:
- NaOH
- SDS - verseifung der zellwand
Neutral:
- acetat
- phosphate
- Resuspensionspuffer führt zur Lyse
- Lysepuffer sorgt für Proteinkomplexe und Denaturation der Nukleasen
- Neutralisationspuffer sorgt für Renaturierung der pDNA
3.10. Nenne 4 verschieden Gruppen von chemischen Agentien die für den Zellaufschluss verwendet werden.
- Chaotrope Mittel-> zunähme Entropie, zerstören Wasserbrücken.
- Tenside
- Lösungsmittel
- Chelatbilder
3.11. Wie ist die Funktionsweise die den einzelnen Stoffgruppen zugesprochen wird? Nenne je ein Agens welches in die jeweilige Gruppe fällt
- Chaotrope Mittel -> brechen die Wasserstoffbrückenbindung, Urea
- Tenside -> verseifen die Lipide in der Zellwand, Natriumsulfat
- Lösungsmittel ->Aufnahme durch die Zellwand, platzen, Ethanol
- Chelatbilder -> EDTA setzt LPS frei
3.12. Nenne die Wirkungsweise der „French Press“! Welches ist der Hauptgrund, der bei der Anwendung der French Press zur Zelllyse führt?
Zylinder mit Nadelohröffnung-Ventil . Darin wird druck aufgebaut. Beim öffnen des Ventils durckdifferenz zieht flügkeit nach außen und die entstehenden Scherkräfte führen zu zellyse. Gas?
3.13. Wie funktioniert ein Hochdruckhomogenisator? Beschreibe!
Durch ein Ventil mit einem engen Spalt wird die Zelllösung gepresst. Danach treffen die Zellen zusätzlich auf einen Stahlring auf.
3.14. Hochdruckhomogenisator:
Welches sind die Mechanismen die zum Zellaufschluss führen?
nenne 4. Welche Prozessparameter haben einfluss auf die Aufschlussgüte
- Kavitation
- Dekompression
- Turbulenzen
- Aufprall zerstören die Zelle.
-Temperatur, Ventildesign, Druck, Flowrate, Zellenkonzentration
