biochimica clinica 1 acidi nucleici Flashcards
estrazione acidi nucleici
scelta del metodo
la scelta si effettua sulla base di:
- materiale di partenza
- tipo di ac nucleico (ssDNA, dsDNA, RNA…)
- applicazione post estrazione (PCR, sequenziamento …)
- qualità dell’ac nucl estratto
estrazioni acidi nucleici
inattivazione delle nucleasi
le nucleasi sono presenti sulla pelle
DNasi e RNasi, le prime degradano il DNA e le seconde RNA
le prime sono termolabili e richiedono ioni metallici
le seconde resistono all’ebollizione prolungata e non richiedono cofattori
estrazioni acidi nucleici
quali sono le tre fasi in comune con tutti i metodi di estrazione?
3 fasi:
1- LISI CELLULARE
2- DEPROTEINIZZAZIONE
3- PRECIPITAZIONE
estrazioni acidi nucleici
prima fase: lisi cellulare
deve essere abbastanza AGGRESSIVA da frammentare il materiale di partenza e abbastanza DELICATA da mantenere integrità dell’ac nucleico.
le tecniche sono:
- distruzione meccanica -> lisi IPOTONICA
- trattamenti chimici -> lisi con DETERGENTI
- digestione enzimatica -> lisi con ENZIMI
estrazioni acidi nucleici
rottura delle cellule
- metodi meccanici .omogeneizzatore .vibrazioni ultrasoniche - metodi non meccanici .congelamento/scongelamneto .shock osmotico .agenti litici
estrazioni acidi nucleici
metodi non meccanici
DETERGENTI rimuovendo i lipidi dissociando le proteine dagli ac nucleici
ENZIMI degradano le proteine di membrana e anche le nucleasi cellulari (es Lisozima… proteasi, proteinasi K)
le moderne soluzioni di lisi usano una combinazione di Detergenti e Proteinasi K
estrazioni acidi nucleici
metodi non meccanici, altri oltre detergenti e enzimi
shock osmotico
congelamento/scongelamento
estrazioni acidi nucleici
metodi non meccanici
tipo di lisi
1- Lisi BLANDA -> DNA plasmidico
piccoli pori nella membrana, si usa lisozima e triton
2- Lisi SPINTA -> ac nucleici totali (DNA cromosomiale, m,r e tRNA)
membrane completamente frantumate con detergenti anionici SDS
estrazioni acidi nucleici
deproteinizzazione del campione lisato
dalla miscela complessa ottenuta (DNA RNA lipidi mono e polisaccaridi proteine e sali)
bisogna RIMUOVERE le proteine dal lisato cellulare
perché potrebbero legarsi agli ac nucleici …
estrazioni acidi nucleici
Le FASI del processo:
1- Rottura e lisi cellulare
2- allontanamento delle membrane (e dei detriti insolubili)
3- allontanamento dei lipidi, proteine e carboidrati (estrazione fenolica)
4- estrazione eterea (per allontanare il fenolo)
5- allontanamento e distruzione di DNA o RNA (facoltativo)
6- precipitazione alcolica e purificazione ac. nucleici
7- dosaggio
estrazioni acidi nucleici
allontanamento delle membrane
con la centrifugazione e si ottiene una separazione:
- una SUPERIORE (sopranatante) che contiene gli ac nucleici
- una INFERIORE (pellet) che contiene membrane e frammenti cellulari
estrazioni acidi nucleici
allontanare le proteine
uguale volume di fenolo al sopranatante, si centrifuga:
- fenolo a pH basico o neutro ( 7,4 - 7,8) per estrarre DNA
inibisce DNAsi –> DNAe RNA nella fase acquosa
- fenolo a pH acido (4,0 - 5,2) per estrarre RNA
inibisce RNAsi –> DNA nella fase organica e RNA in quella acquosa
estrazioni acidi nucleici
sistemi di deproteinizzazione
1- fenolo / cloroformio / alcol isoamilico (49:49:1)
2- cloroformio / alcol isoamilico (49:1)
- Sodio Dodecil Solfato (SDS) è un detergente anionico che si lega alle proteine alterandone la struttura
- Enzimi Proteolitici, ad es PROTEINASI K che è un’endopeptidasi aspecifica molto attiva
estrazioni acidi nucleici
estrazione eterea
per allontanare eventuali residui di fenolo
- dopo centrifugazione l’etere dovrebbe essere nella parte superiore e venire allontanato e la soluzione che rimane dovrebbe contenere gli ac nucleici
estrazioni acidi nucleici
allontanamento di DNA o RNA
si elimina uno dei due componenti usando
o la ribonucleasi (RNAsi)
o la desossiribonucleasi (DNAsi)
estrazioni acidi nucleici
precipitazione alcolica
Etanolo fa precipitare gli acidi nucleici
se bassa quantità di sc nucleici si può aggiungere un carrier inerte
si aggiungono cationi monovalenti per favorire formazione di sali (Na+)
ISopropanolo può essere usato per precipitare DNA
isopropanolo è meno volatile dell Etanolo
estrazioni acidi nucleici
risospensione dell’acido nucleico
lavaggio del pellet
in etanolo al 70% e ricentrifugsto e si allontanano i sali
risospensione del DNA
può così essere dosato e utilizzato…
estrazioni acidi nucleici
separare il DNA del plasmide dal DNA cromosomico batterico
in base alle dimensioni e alle conformazioni.
di solito superavvolto e non si denatura
bisogna renderlo in stato rilassato
con centrifugazione il DNA batterico sedimenta e quello plasmidico nel supernatante
estrazioni acidi nucleici
analisi acidi nucleici
spettrofotometro
elettroforesi su gel
estrazioni acidi nucleici
letture spettrofotometriche
letture a 260nm DNA
e a 280nm RNA
se picco di assorbimento a 270nm c’è presenza di fenolo da eliminare
estrazioni acidi nucleici
per visualizzare il DNA su gel
metodo fluorimetrico
bisogna colorarlo con Bromuro di Etidio che emette fluorescenza eccitato da uv
la intensità di fluorescenza proporzionale alla quantità di DNA
estrazioni acidi nucleici
metodo colorimetrico
utilizza sempre lo spettrofotometro
misura complessi colorati con il ribosio o il desossiribosio e permette di valutare esattamente la quantità di RNA o DNA
DNA colorazione celeste
RNA colorazione verde
elettroforesi del DNA
DNA carico negativamente viene attirato dall’anodo
e ti permette di separare identificare e purificare i frammenti di DNA migrando attraverso:
poliacrilamide
agarosio
elettroforesi del DNA
fattori v
che influenzano la velocità di migrazione del DNA sul gel
- dimensione della molecola di DNA
- concentrazione dell’agarosio
- conformazione del DNA
- voltaggio
- composizione del tampone di corsa
elettroforesi del DNA
come incide la conformazione del DNA sulla migrazione
- superavvolta -> più veloce perché più compatta
- circolare -> più lenta perché più ingambrante
- lineare -> a metà
la presenza di bromuro di etidio riduce la velocità di migrazione del 15%
elettroforesi del DNA
estrazione del DNA da gel
si usa il gel extraction kit -> QIAquick
usa lo stesso principio del protocollo di purificazione della PCR
si utilizza per DNA da 70bp a 10kb processa fino a 400mg di agarosio
enzima di restrizione
enzima in grado di riconoscere specifiche sequenze di basi lungo il filamento di DNA e tagliare esattamente in corrispondenza di queste
con essi è possibile tagliare il genoma umano in frammenti più piccoli e maneggiabili (frammenti di restrizione) o ritagliare un certo gene o modificarlo
elettroforesi del DNA
digestione del prodotto della PCR con enzimi di restrizione
deve essere tagliato tra i siti:
HindIII e SalI
elettroforesi del DNA
ligasi
la DNA ligasi può riparare o unire due frammenti di DNA
ligating blunt ends –> scarsa efficienza
ligating sticky ends –> molto più efficiente
la più utilizzata è quella del batteriofago T4, ATP dipendente
per la sua attività serve ATP un gruppo fosfato al 5’ e un OH al 3’
elettroforesi del DNA
meccanismo della ligasi
avviene in 3 fasi:
1- ligasi reagisce con atp
2- ligasi-atp reagisce con il P al 5’
3- il gruppo OH reagisce con 5’ P e determina formazione di un nuovo legame fosfo diesterico
ottimizzazione della ligasi
temperatura e tempo di reazione
concentrazione totale del DNA
concentrazione dell’inserto e del vettore
La fosfatasi alcalina ottimizza la reazione di ligazione perché evita la ricircolazione del vettore
ligasi
quando i frammenti sono blunt ended
per ottimizzare l’unione si utilizzano
linkers
adattatori
produzione di sticky ends con una coda omopolimerica
clonaggio del DNA
ottenere molreplici copie della molecola di DNA di partenza
4 fasi:
1- LIGASI la sequenza di DNA inserita in vettore
2- TRASFORMAZIONE il vettore inserito in una cellula
3- SELEZIONE le cellule così trasformate devono essere riconosciute
4- CRESCITA COLONIE queste cellule vengono amplificate
clonaggio del DNA
ligasi
il vettore deve essere tagliato e le estremità del DNA di interesse devono legarsi a quelle del vettore richiudendolo
clonaggio del DNA
taglio
DNA ricombinante
il DNA di interesse e il vettore devono essere tagliati da uno stesso enzima di restrizione
e vengono poi legati con l’enzima ligasi
clonaggio del DNA
enzimi di restrizione
nei procarioti sono essenziali per degradare filamenti estranei di DNA
ogni enzima di restrizione riconosce una sequenza particolare sul DNA e sono di 4,6 o 8 nucleotidi …spesso palindromi.
ci sono TRE classi di enzimi di restrizione:
quelli di classe I e III sono attivi nella stessa molecola
quelli di classe II sono attivi su più molecole e più precisi
hanno attività di restrizione e metilazione
clonaggio del DNA
tipo di taglio degli enzimi di restrizione
possono tagliare: - estremità piatte (blunt) es SmaI - estremità coesive (sticky) sporgenti al 5' (5' protruding) es EcoRI - estremità coesive sporgenti al 3' es PstI
clonaggio del DNA
ligasi
enzima che forma legami fosfodiesterici tra estremità 3’-OH e 5’-P di molecole di DNA adiacenti
richiede ATP come substrato
Le estremità coesive facilitano il compito, tra 4 e 37 gradi da 1h a 24h
Le estremità blunt hanno bisogno di basse temperature e elevata concentrazione dell’enzima
clonaggio del DNA
quali sono le ligasi più usate?
quella codificata dal batteriofago T4 ottenuta da cellule di E. coli
clonaggio del DNA
ricircolazione vettore
in molti casi il vettore ricircolarizza senza inserimento del DNA di interesse
clonaggio del DNA
fosfatasi alcalina
per ovviare al problema della ricircolarizzazione si usa la fosfatasi alcalina che rimuove il gruppo Fosfato (P) dall’estremità 5’
il vettore defosforilato non può essere ligato…quindi si può usare anche una concentrazione più alta di vettore
- il vettore può essere ancora ligato usando il P dell’inserto
clonaggio del DNA
inserimento
- se si usano estremità nette si possono ligare qualsiasi parte con estremità nette…problema ritagliare l’inserto perché gli enzimi non riconoscono il punto di inserzione -> meno efficiente
- se si usano estremità coesive identiche lo stesso enzima di restrizione che le ha tagliate può liberare l’inserto clonato -> molto efficiente….ma non si può sapere l’orintamento
- estremità coesive differenti….si usano due enzimi diversi per il taglio e riusandoli con il plasmide si riottiene l’inserto…si conosce l’orientamento, le estremità coesive sono facili da legare e il vettore così tagliato non circolarizza
clonaggio del DNA
vettori
si usano molteplici vettori in base alla dimensione dell'inserto: plasmidi fagi cosmidi bac yac
clonaggio del DNA
plasmidi
molecole circolare ed extracromosomiali di DNA in grado di replicarsi senza essere integrati nel genoma batterico.
contengono:
ORI sequenza di origine della replicazione dell’E. coli
MCS (multi cloning site) sequenza con raggruppate sequenze riconosciute da diversi enzimi di restrizione…di solito ingegnerizzata e compresa tra un promotore e un terminatore
DNA esogeno (inserto)
MARCATORE SELEZIONABILE una sequenza codificante per un gene che conferisce un vantaggio selettivo (es resistenza agli antibiotici)
clonaggio del DNA
plasmidi piccoli
più sono di dimensioni ridotte
più sono maneggevoli:
più resistenti, più facile estrali, più efficiente la trasformazione, più è veloce a rinaturizzarsi
clonaggio del DNA
trasformazione
si intende l’inserimento del DNA esogeno in cellule batteriche
(l’inserimento di DNA eterologo in cellule eucariote si dice TRASFEZIONE)
e avviene con
un metodo elettrico (elettroporazione)
o un metodo chimico (trattamento con cloruro di calcio)
clonaggio del DNA
trasformazione …controllo
si possono produrre tre tipi di batteri:
vuoti
contenenti solo il vettore
contenti i batteri con vettore con inserto
- per selezionare quelli con i vettori si usa come marcatore selezionabile un gene di resistenza a un antibiotico…tutti i batteri resistenti a quell’antibiotico hanno il vettore
DIFFICILE capire quali quelli con inserto (si usa ad esempio alfa complementazione)
clonaggio del DNA
alfa complementazione
si usano vettori pUC che permettono con il promotore del lattosio di attivare il gene lacZ e di rendere un batterio in grado di attivare una beta galattosidasi e di reagire con un substrato e produrre un colore blu
se il vettore ha l’inserto, questo si inserisce nel gene che attiva la beta galattosidasi e non la rende attivabile e quindi le colonie con inserto rimangono bianche
se inserto piccolo possono esserci falsi e al contrario basta una piccola delezione per falsificare anche il risultato di un vettore vuoto
clonaggio del DNA
purificazione dei plasmidi
per denaturazione
i plasmidi si rinaturano più velocemente
e per centrifugazione si separano
oppure fatta per ultracentrifugazione in gradiente
PCR (reazione di polimerizzazione a catena)
tecnica di clonaggio in vitro
permette di produrre grandi quantità di specifici frammenti di DNA …
permette di studiare e purificare qualsiasi sequenza di DNA o mRNA
può amplificare un tratto di DNA per più di un milione di copie
PCR
elementi della reazione in vitro
1- DNA stampo
2- DNA polimerasi termostabile (95gradi)
3- i 4 desossinucleotidi trifosfati (dNTPs)
4- un buffer contenente Mg, è un cofattore della polimerasi e ne potenzia la processività
5- due oligonucleotidi (primer)
PCR
cicli di reazione
ogni ciclo consiste di tre fasi:
1- denaturazione …il DNA stampo viene denaturato (90-95 gradi)
2- appaiamento …i primer si appaiano con il DNA stampo
3- sintesi 72 gradi è la temperatura ottimale per funzionamento della Taq polimerasi
PCR
ottimizzazione della pcr
- concentrazione di Mg
- scelta dell’enzima
- progettazione dei primers …tra 20 e 30 nucleotidi mai meno di 16, con GC tra 45 e 50%, non contenere sequenze complementari, ripetute o invertite per evitare strutture a forcina
- quantità e qualità dello stampo
- paramtri dei cicli
- controllo di crosscontaminazioni con altri acidi nucleici
PCR
progettazione pcr
1- scegliere la strategia (stampo DNA o RNA)
2- dimensioni della regione da amplificare
3- usare programmi per progettare i primers
4- verificare la validità biologica dei primers con BLASTN ( è un software che permette di allineare la sequenza con quelle nei database di sequenze nucleotidiche
5- verificare la sequenza attraverso sequenziamento
PCR
vantaggi
- sensibilità e rapidità
- analisi simultanea di molti campione
- analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione
- analisi del DNA degradato o incluso in mezzi strani o fissato
PCR
svantaggi
- rischio di contaminazioni…falsi positivi
- efficienza variabile di amplificazione a seconda della sequenza
- richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare (per i primers)
- può sintetizzare frammenti corti
- la sintesi è imprecisa e può introdurre errori
PCR
RT-PCR
per rilevare uno specifico mRNA con retrotrascrizione: 1- estrazione RNA 2- purificazione mRNA, o usare primers 3- sintesi di cDNA con trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNA dipendente)
PCR
protocollo retrascrizione
1 estrazione e purificazione RNA 1microgrammo
2 la trascrittasi del virus della leucemia di topo (MMLV)
3 primer
4 incubare per un’ora a una data temperatura
PCR
applicazioni
- tipizzazione di marcatori genetici
- screening mutazionale
- identificazione di mutazioni puntiformi
- identificazione di nuovi geni
- studi di espressione genica
- mutagenesi in vitro
PCR
real time PCR
permette di analizzare in tempo reale la reazione e di ottenere dati quantitativi…valutare il numero delle copie di stampo
può essere relativa o assoluta
PCR
utilizzo
su DNA PCR
su mRNA RT-PCR
