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diagnostica e medicina di laboratorio > biochimica clinica 1 acidi nucleici > Flashcards

biochimica clinica 1 acidi nucleici Flashcards

1
Q

estrazione acidi nucleici

scelta del metodo

A

la scelta si effettua sulla base di:

  • materiale di partenza
  • tipo di ac nucleico (ssDNA, dsDNA, RNA…)
  • applicazione post estrazione (PCR, sequenziamento …)
  • qualità dell’ac nucl estratto
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Q

estrazioni acidi nucleici

inattivazione delle nucleasi

A

le nucleasi sono presenti sulla pelle
DNasi e RNasi, le prime degradano il DNA e le seconde RNA
le prime sono termolabili e richiedono ioni metallici
le seconde resistono all’ebollizione prolungata e non richiedono cofattori

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3
Q

estrazioni acidi nucleici

quali sono le tre fasi in comune con tutti i metodi di estrazione?

A

3 fasi:
1- LISI CELLULARE
2- DEPROTEINIZZAZIONE
3- PRECIPITAZIONE

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4
Q

estrazioni acidi nucleici

prima fase: lisi cellulare

A

deve essere abbastanza AGGRESSIVA da frammentare il materiale di partenza e abbastanza DELICATA da mantenere integrità dell’ac nucleico.
le tecniche sono:
- distruzione meccanica -> lisi IPOTONICA
- trattamenti chimici -> lisi con DETERGENTI
- digestione enzimatica -> lisi con ENZIMI

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5
Q

estrazioni acidi nucleici

rottura delle cellule

A 
- metodi meccanici
   .omogeneizzatore
   .vibrazioni ultrasoniche
- metodi non meccanici
   .congelamento/scongelamneto
   .shock osmotico
   .agenti litici
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6
Q

estrazioni acidi nucleici

metodi non meccanici

A

DETERGENTI rimuovendo i lipidi dissociando le proteine dagli ac nucleici
ENZIMI degradano le proteine di membrana e anche le nucleasi cellulari (es Lisozima… proteasi, proteinasi K)
le moderne soluzioni di lisi usano una combinazione di Detergenti e Proteinasi K

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7
Q

estrazioni acidi nucleici

metodi non meccanici, altri oltre detergenti e enzimi

A

shock osmotico

congelamento/scongelamento

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8
Q

estrazioni acidi nucleici
metodi non meccanici
tipo di lisi

A

1- Lisi BLANDA -> DNA plasmidico
piccoli pori nella membrana, si usa lisozima e triton

2- Lisi SPINTA -> ac nucleici totali (DNA cromosomiale, m,r e tRNA)
membrane completamente frantumate con detergenti anionici SDS

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9
Q

estrazioni acidi nucleici

deproteinizzazione del campione lisato

A

dalla miscela complessa ottenuta (DNA RNA lipidi mono e polisaccaridi proteine e sali)
bisogna RIMUOVERE le proteine dal lisato cellulare
perché potrebbero legarsi agli ac nucleici …

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10
Q

estrazioni acidi nucleici

Le FASI del processo:

A

1- Rottura e lisi cellulare
2- allontanamento delle membrane (e dei detriti insolubili)
3- allontanamento dei lipidi, proteine e carboidrati (estrazione fenolica)
4- estrazione eterea (per allontanare il fenolo)
5- allontanamento e distruzione di DNA o RNA (facoltativo)
6- precipitazione alcolica e purificazione ac. nucleici
7- dosaggio

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11
Q

estrazioni acidi nucleici

allontanamento delle membrane

A

con la centrifugazione e si ottiene una separazione:

  • una SUPERIORE (sopranatante) che contiene gli ac nucleici
  • una INFERIORE (pellet) che contiene membrane e frammenti cellulari
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12
Q

estrazioni acidi nucleici

allontanare le proteine

A

uguale volume di fenolo al sopranatante, si centrifuga:
- fenolo a pH basico o neutro ( 7,4 - 7,8) per estrarre DNA
inibisce DNAsi –> DNAe RNA nella fase acquosa
- fenolo a pH acido (4,0 - 5,2) per estrarre RNA
inibisce RNAsi –> DNA nella fase organica e RNA in quella acquosa

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13
Q

estrazioni acidi nucleici

sistemi di deproteinizzazione

A

1- fenolo / cloroformio / alcol isoamilico (49:49:1)
2- cloroformio / alcol isoamilico (49:1)
- Sodio Dodecil Solfato (SDS) è un detergente anionico che si lega alle proteine alterandone la struttura
- Enzimi Proteolitici, ad es PROTEINASI K che è un’endopeptidasi aspecifica molto attiva

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14
Q

estrazioni acidi nucleici

estrazione eterea

A

per allontanare eventuali residui di fenolo
- dopo centrifugazione l’etere dovrebbe essere nella parte superiore e venire allontanato e la soluzione che rimane dovrebbe contenere gli ac nucleici

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15
Q

estrazioni acidi nucleici

allontanamento di DNA o RNA

A

si elimina uno dei due componenti usando
o la ribonucleasi (RNAsi)
o la desossiribonucleasi (DNAsi)

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16
Q

estrazioni acidi nucleici

precipitazione alcolica

A

Etanolo fa precipitare gli acidi nucleici
se bassa quantità di sc nucleici si può aggiungere un carrier inerte
si aggiungono cationi monovalenti per favorire formazione di sali (Na+)
ISopropanolo può essere usato per precipitare DNA
isopropanolo è meno volatile dell Etanolo

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17
Q

estrazioni acidi nucleici

risospensione dell’acido nucleico

A

lavaggio del pellet
in etanolo al 70% e ricentrifugsto e si allontanano i sali
risospensione del DNA
può così essere dosato e utilizzato…

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18
Q

estrazioni acidi nucleici

separare il DNA del plasmide dal DNA cromosomico batterico

A

in base alle dimensioni e alle conformazioni.
di solito superavvolto e non si denatura
bisogna renderlo in stato rilassato
con centrifugazione il DNA batterico sedimenta e quello plasmidico nel supernatante

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19
Q

estrazioni acidi nucleici

analisi acidi nucleici

A

spettrofotometro

elettroforesi su gel

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20
Q

estrazioni acidi nucleici

letture spettrofotometriche

A

letture a 260nm DNA
e a 280nm RNA
se picco di assorbimento a 270nm c’è presenza di fenolo da eliminare

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21
Q

estrazioni acidi nucleici
per visualizzare il DNA su gel
metodo fluorimetrico

A

bisogna colorarlo con Bromuro di Etidio che emette fluorescenza eccitato da uv
la intensità di fluorescenza proporzionale alla quantità di DNA

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22
Q

estrazioni acidi nucleici

metodo colorimetrico

A

utilizza sempre lo spettrofotometro
misura complessi colorati con il ribosio o il desossiribosio e permette di valutare esattamente la quantità di RNA o DNA
DNA colorazione celeste
RNA colorazione verde

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23
Q

elettroforesi del DNA

A

DNA carico negativamente viene attirato dall’anodo
e ti permette di separare identificare e purificare i frammenti di DNA migrando attraverso:
poliacrilamide
agarosio

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24
Q

elettroforesi del DNA
fattori v
che influenzano la velocità di migrazione del DNA sul gel

A
  • dimensione della molecola di DNA
  • concentrazione dell’agarosio
  • conformazione del DNA
  • voltaggio
  • composizione del tampone di corsa
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25
Q

elettroforesi del DNA

come incide la conformazione del DNA sulla migrazione

A
  • superavvolta -> più veloce perché più compatta
  • circolare -> più lenta perché più ingambrante
  • lineare -> a metà
    la presenza di bromuro di etidio riduce la velocità di migrazione del 15%
26
Q

elettroforesi del DNA

estrazione del DNA da gel

A

si usa il gel extraction kit -> QIAquick
usa lo stesso principio del protocollo di purificazione della PCR
si utilizza per DNA da 70bp a 10kb processa fino a 400mg di agarosio

27
Q

enzima di restrizione

A

enzima in grado di riconoscere specifiche sequenze di basi lungo il filamento di DNA e tagliare esattamente in corrispondenza di queste
con essi è possibile tagliare il genoma umano in frammenti più piccoli e maneggiabili (frammenti di restrizione) o ritagliare un certo gene o modificarlo

28
Q

elettroforesi del DNA

digestione del prodotto della PCR con enzimi di restrizione

A

deve essere tagliato tra i siti:

HindIII e SalI

29
Q

elettroforesi del DNA

ligasi

A

la DNA ligasi può riparare o unire due frammenti di DNA
ligating blunt ends –> scarsa efficienza
ligating sticky ends –> molto più efficiente
la più utilizzata è quella del batteriofago T4, ATP dipendente
per la sua attività serve ATP un gruppo fosfato al 5’ e un OH al 3’

30
Q

elettroforesi del DNA

meccanismo della ligasi

A

avviene in 3 fasi:
1- ligasi reagisce con atp
2- ligasi-atp reagisce con il P al 5’
3- il gruppo OH reagisce con 5’ P e determina formazione di un nuovo legame fosfo diesterico

31
Q

ottimizzazione della ligasi

A

temperatura e tempo di reazione
concentrazione totale del DNA
concentrazione dell’inserto e del vettore
La fosfatasi alcalina ottimizza la reazione di ligazione perché evita la ricircolazione del vettore

32
Q

ligasi

quando i frammenti sono blunt ended

A

per ottimizzare l’unione si utilizzano
linkers
adattatori
produzione di sticky ends con una coda omopolimerica

33
Q

clonaggio del DNA

A

ottenere molreplici copie della molecola di DNA di partenza
4 fasi:
1- LIGASI la sequenza di DNA inserita in vettore
2- TRASFORMAZIONE il vettore inserito in una cellula
3- SELEZIONE le cellule così trasformate devono essere riconosciute
4- CRESCITA COLONIE queste cellule vengono amplificate

34
Q

clonaggio del DNA

ligasi

A

il vettore deve essere tagliato e le estremità del DNA di interesse devono legarsi a quelle del vettore richiudendolo

35
Q

clonaggio del DNA
taglio
DNA ricombinante

A

il DNA di interesse e il vettore devono essere tagliati da uno stesso enzima di restrizione
e vengono poi legati con l’enzima ligasi

36
Q

clonaggio del DNA

enzimi di restrizione

A

nei procarioti sono essenziali per degradare filamenti estranei di DNA
ogni enzima di restrizione riconosce una sequenza particolare sul DNA e sono di 4,6 o 8 nucleotidi …spesso palindromi.
ci sono TRE classi di enzimi di restrizione:
quelli di classe I e III sono attivi nella stessa molecola
quelli di classe II sono attivi su più molecole e più precisi
hanno attività di restrizione e metilazione

37
Q

clonaggio del DNA

tipo di taglio degli enzimi di restrizione

A 
possono tagliare:
- estremità piatte (blunt)
es SmaI
- estremità coesive (sticky) sporgenti al 5' (5' protruding)
es EcoRI
- estremità coesive sporgenti al 3'
es PstI
38
Q

clonaggio del DNA

ligasi

A

enzima che forma legami fosfodiesterici tra estremità 3’-OH e 5’-P di molecole di DNA adiacenti
richiede ATP come substrato
Le estremità coesive facilitano il compito, tra 4 e 37 gradi da 1h a 24h
Le estremità blunt hanno bisogno di basse temperature e elevata concentrazione dell’enzima

39
Q

clonaggio del DNA

quali sono le ligasi più usate?

A

quella codificata dal batteriofago T4 ottenuta da cellule di E. coli

40
Q

clonaggio del DNA

ricircolazione vettore

A

in molti casi il vettore ricircolarizza senza inserimento del DNA di interesse

41
Q

clonaggio del DNA

fosfatasi alcalina

A

per ovviare al problema della ricircolarizzazione si usa la fosfatasi alcalina che rimuove il gruppo Fosfato (P) dall’estremità 5’
il vettore defosforilato non può essere ligato…quindi si può usare anche una concentrazione più alta di vettore
- il vettore può essere ancora ligato usando il P dell’inserto

42
Q

clonaggio del DNA

inserimento

A
  • se si usano estremità nette si possono ligare qualsiasi parte con estremità nette…problema ritagliare l’inserto perché gli enzimi non riconoscono il punto di inserzione -> meno efficiente
  • se si usano estremità coesive identiche lo stesso enzima di restrizione che le ha tagliate può liberare l’inserto clonato -> molto efficiente….ma non si può sapere l’orintamento
  • estremità coesive differenti….si usano due enzimi diversi per il taglio e riusandoli con il plasmide si riottiene l’inserto…si conosce l’orientamento, le estremità coesive sono facili da legare e il vettore così tagliato non circolarizza
43
Q

clonaggio del DNA

vettori

A 
si usano molteplici vettori in base alla dimensione dell'inserto:
plasmidi
fagi
cosmidi
bac
yac
44
Q

clonaggio del DNA

plasmidi

A

molecole circolare ed extracromosomiali di DNA in grado di replicarsi senza essere integrati nel genoma batterico.
contengono:
ORI sequenza di origine della replicazione dell’E. coli
MCS (multi cloning site) sequenza con raggruppate sequenze riconosciute da diversi enzimi di restrizione…di solito ingegnerizzata e compresa tra un promotore e un terminatore
DNA esogeno (inserto)
MARCATORE SELEZIONABILE una sequenza codificante per un gene che conferisce un vantaggio selettivo (es resistenza agli antibiotici)

45
Q

clonaggio del DNA

plasmidi piccoli

A

più sono di dimensioni ridotte
più sono maneggevoli:
più resistenti, più facile estrali, più efficiente la trasformazione, più è veloce a rinaturizzarsi

46
Q

clonaggio del DNA

trasformazione

A

si intende l’inserimento del DNA esogeno in cellule batteriche
(l’inserimento di DNA eterologo in cellule eucariote si dice TRASFEZIONE)
e avviene con
un metodo elettrico (elettroporazione)
o un metodo chimico (trattamento con cloruro di calcio)

47
Q

clonaggio del DNA

trasformazione …controllo

A

si possono produrre tre tipi di batteri:
vuoti
contenenti solo il vettore
contenti i batteri con vettore con inserto
- per selezionare quelli con i vettori si usa come marcatore selezionabile un gene di resistenza a un antibiotico…tutti i batteri resistenti a quell’antibiotico hanno il vettore
DIFFICILE capire quali quelli con inserto (si usa ad esempio alfa complementazione)

48
Q

clonaggio del DNA

alfa complementazione

A

si usano vettori pUC che permettono con il promotore del lattosio di attivare il gene lacZ e di rendere un batterio in grado di attivare una beta galattosidasi e di reagire con un substrato e produrre un colore blu
se il vettore ha l’inserto, questo si inserisce nel gene che attiva la beta galattosidasi e non la rende attivabile e quindi le colonie con inserto rimangono bianche
se inserto piccolo possono esserci falsi e al contrario basta una piccola delezione per falsificare anche il risultato di un vettore vuoto

49
Q

clonaggio del DNA

purificazione dei plasmidi

A

per denaturazione
i plasmidi si rinaturano più velocemente
e per centrifugazione si separano
oppure fatta per ultracentrifugazione in gradiente

50
Q

PCR (reazione di polimerizzazione a catena)

A

tecnica di clonaggio in vitro
permette di produrre grandi quantità di specifici frammenti di DNA …
permette di studiare e purificare qualsiasi sequenza di DNA o mRNA
può amplificare un tratto di DNA per più di un milione di copie

51
Q

PCR

elementi della reazione in vitro

A

1- DNA stampo
2- DNA polimerasi termostabile (95gradi)
3- i 4 desossinucleotidi trifosfati (dNTPs)
4- un buffer contenente Mg, è un cofattore della polimerasi e ne potenzia la processività
5- due oligonucleotidi (primer)

52
Q

PCR

cicli di reazione

A

ogni ciclo consiste di tre fasi:
1- denaturazione …il DNA stampo viene denaturato (90-95 gradi)
2- appaiamento …i primer si appaiano con il DNA stampo
3- sintesi 72 gradi è la temperatura ottimale per funzionamento della Taq polimerasi

53
Q

PCR

ottimizzazione della pcr

A
  • concentrazione di Mg
  • scelta dell’enzima
  • progettazione dei primers …tra 20 e 30 nucleotidi mai meno di 16, con GC tra 45 e 50%, non contenere sequenze complementari, ripetute o invertite per evitare strutture a forcina
  • quantità e qualità dello stampo
  • paramtri dei cicli
  • controllo di crosscontaminazioni con altri acidi nucleici
54
Q

PCR

progettazione pcr

A

1- scegliere la strategia (stampo DNA o RNA)
2- dimensioni della regione da amplificare
3- usare programmi per progettare i primers
4- verificare la validità biologica dei primers con BLASTN ( è un software che permette di allineare la sequenza con quelle nei database di sequenze nucleotidiche
5- verificare la sequenza attraverso sequenziamento

55
Q

PCR

vantaggi

A
  • sensibilità e rapidità
  • analisi simultanea di molti campione
  • analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione
  • analisi del DNA degradato o incluso in mezzi strani o fissato
56
Q

PCR

svantaggi

A
  • rischio di contaminazioni…falsi positivi
  • efficienza variabile di amplificazione a seconda della sequenza
  • richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare (per i primers)
  • può sintetizzare frammenti corti
  • la sintesi è imprecisa e può introdurre errori
57
Q

PCR

RT-PCR

A 
per rilevare uno specifico mRNA
con retrotrascrizione:
1- estrazione RNA
2- purificazione mRNA, o usare primers
3- sintesi di cDNA con trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNA dipendente)
58
Q

PCR

protocollo retrascrizione

A

1 estrazione e purificazione RNA 1microgrammo
2 la trascrittasi del virus della leucemia di topo (MMLV)
3 primer
4 incubare per un’ora a una data temperatura

59
Q

PCR

applicazioni

A
  • tipizzazione di marcatori genetici
  • screening mutazionale
  • identificazione di mutazioni puntiformi
  • identificazione di nuovi geni
  • studi di espressione genica
  • mutagenesi in vitro
60
Q

PCR

real time PCR

A

permette di analizzare in tempo reale la reazione e di ottenere dati quantitativi…valutare il numero delle copie di stampo
può essere relativa o assoluta

61
Q

PCR

utilizzo

A

su DNA PCR

su mRNA RT-PCR

diagnostica e medicina di laboratorio (1 decks)

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