Biochemie Flashcards
B-DNA
>Doppelhelix ist rechtsgängig >Rotation pro Basenpaar: 35,9° >Basenpaare pro Windung: 10,5 >Steighöhe pro Bp entlang der Achse: 3,4 A >Steighöhe pro Windung: 33,2 A >Glykosylwinkel: anti >Durchmesser: 23,7 A
A-DNA
>Doppelhelix ist rechtsgängig >Rotation pro Basenpaar: 33,6° >Basenpaare pro Windung: 11 bp >Steighöhe pro Bp entlang der Achse: 2,3 A >Steighöhe pro Windung: 24,6 A >Glykosylwinkel: anti >Durchmesser: 25,5 A
Z-DNA
> Doppelhelix ist linksgängig
Rotation pro Basenpaar: 60°/2
Basenpaare pro Windung: 12 bp
Steighöhe pro Bp entlang der Achse: 3,7 A
Steighöhe pro Windung: 45,6 A
Glykosylwinkel: Pyrimidin: anti; Purin: syn
Durchmesser: 18,4 A
wieviel % der Zucker treten in
cyclischer Form auf?
90%
Ursprung der Basen
> Die Biosynthese der Purine und Pyrimidine erfolgt aus
Aminosäuren
Adenin und Guanin aus Aspartat, Glycin und Glutamin
Cytosin und Thymian und Uracil aus Aspartat
Ursprung der Basen ohne
Aminosäuren
> RNA kann katalytisch aktiv sein
Basen können evolutionär aus vulkanischen Gasen (HCN) unter
Druck und hoher Temperatur (Kondensation) entstehen
kann im Labor reproduziert werden
Chargaff’s rules
> Erwin Chargaff
die DNA einer Zelle sollte ein 1:1 Verhältnis von Pyrimidin und
Purin haben
die Menge an Cytosin sollte der von Guanin äquivalent sein, so
auch die von Adenin der von Thymin
Wieviel WSBB bilden Adenin
und Thymin?
2
Wieviel WSBB bilden Guanin
und Cytosin?
3
Eigenschaften der WSBB
zwischen Purin und Pyrimidin
> die WSBB sind zwar schwach, aber zielgerichtet
H ist elektropositiv (Donor Heteroatom), O/N ist elektronegativ
(Akzeptor Heteroatom)
WSBB sind am stärksten, wenn sie linear sind (180°)
WSBB-Bildung ist ein kooperativer Prozess
wozu werden diese
Absorptionseigenschaften
gebraucht?
> um die ‘‘Schmelztemperatur’’ der DNA-Doppelhelix zu bestimmen
Absorptionsmaximum bei 260 nm (AMP und UMP)
was absorbiert stärker: ssDNA
oder dsDNA?
> ssDNA hat die höhere Absorption, weil die Atome freiliegen und
die π-Elektronen besser mit dem Solvent interagieren können
wie bestimmt man die
Schmelztemperatur der DNA?
> die Schmelztemperatur ist direkt abhängig von der GCKonzentration,
da diese Bindung durch drei WSBB stärker und
damit relevanter ist
die Schmelztemperatur ist definiert als die Temperatur, bei der
50 % der DNA einzelsträngig vorliegt
Röntgenstrukturanalyse der
DNA
>Rosalind Franklyn >Röntgenbeugungsdiagramm der DNA (man kann DNA nicht kristallisieren!) >starke Beugung bei 3,4 A -> Abstand zwischen den Basenpaaren
Was ist die Keto-Enol-
Tautomerie?
> Formalismus, um das Gleichgewicht zu beschreiben und NICHT
die Wanderung von Atomen
Lässt Guanin wie Adenin wirken
tautomere Formen Uracil
Lactam, Latim, double Lactim
was ist stabiler: DNA oder
RNA?
> in alkalischer Lösung ist RNA durch die 2’OH-Gruppe
hydrolyseempfindlicher
Eigenschaften A-DNA
> die relativ starre Form der A-DNA geht durch Wasserverlust aus
der B-Form hervor (wenn der Wassergehalt unter ca. 75 % absinkt)
die Helix der A-Form ist breiter und kürzer als die der B-DNA-Helix
und ihre Basenpaare sind gegenüber der Helixachse stärker
geneigt und zeigen nicht senkrecht darauf
die Basenpaare sind durch die C3’-Endokonformation ggü. der
normalen Anordnung in der Helix um 11° gekippt
die Phosphate und andere Gruppen der A-Helix binden weniger
H2O-Moleküle als die B-DNA
RNA und DNA-RNA-Hybride liegen teilweise in der AKonformation
vor
die Lage der 2’-OH-Gruppe in der Ribose verhindert aus
sterischen Gründen die B-Form -> das 2’-O-Atom würde drei
Atomen der benachbarten Phosphatgruppe und einem Atom der
nächsten Base zu nahe kommen
in der A-Helix zeigt das 2’-O-Atom nach außen und von den
anderen Atomen weg
die C-3’-Endo-Faltung der A-DNA führt zu einer Neigung der
Basenpaare um 19° aus der senkrechten Helixachse
Bei RNA-Helices trägt auch die sterische Behinderung durch die
2’-OH-Gruppe zur Ausbildung der A-Form bei
Eigenschaften B-DNA
> unter physiologischen Bedingungen liegt der Großteil der DNA in
der B-Form vor
das C-2’-Atom liegt außerhalb der Ebene (C-2’-Endokonformation)
Eigenschaften Z-DNA
> linksgängige Helix, bei der die Phosphatgruppen des Rückgrats
eine Zickzacklinie bilden
DNA-Oligomere wie CGCGCG nehmen unter bestimmten
Bedingungen die Z-Konformation an
wird durch hohen Salzgehalt begünstigt
tritt in CG-reichen Sequenzen auf, ist aber nicht auf diese
beschränkt
die Phosphatgruppen rücken näher aneinander ->
elektrostatische Abstoßung
wird durch negatives supercoiling stabilisiert
Z-DNA während der Transkription:
um das Nukleosom: positive supercoiled DNA
zwischen den Nukleosomen: negative supercoiled DNA (Z-DNA ->
verhindert, dass sich die DNA weiter um die Nukleosomen wickelt)
während der Transkription: negative supercoiled DNA (Z-DNA)
Welche Konformationen
können Purine annehmen?
> sowohl syn, als auch anti
>freie Drehbarkeit an der glykosidischen Bindung
Welche Konformationen
können Pyrimidine
annehmen?
> nur die anti Konformation
-> bei der syn-Konformation wäre die sterische Hinderung
zwischen den O-Atomen zu groß
wie entstehen die große und
die kleine Furche?
> dadurch, dass sich die glykosidischen Bindungen eines
Basenpaares nicht diametral gegenüberstehen
Eigenschaften große und
kleine Furche der DNA
> die kleine Furche enthält das O-2 eines Pyrimidins und das N-3
eines Purins des Basenpaares, die große Furche befindet sich auf
der gegenüberliegenden Seite
auch z.B. Methylgruppen des Thymins liegen in der großen Furche
in der B-DNA ist die große Furche breiter (1,2 nm gegenüber 0,6
nm) und tiefer (0,85 nm ggü. 0,75 nm) als die kleine
jede Furche ist mit potenziellen Donator- und Akzeptoratomen
für WSBB ausgekleidet, die spezifische WW mit Proteinen
ermöglichen
in der kleinen Furche können das N-3 von Adenin und Guanin
sowie das O-2 von Thymin und Cytosin als WSBB-Akzeptoren
dienen; die Aminogruppe am C-2 von Guanin kann WSBB-Donator
sein
in der großen Furche ist das N-7 des Guanins und Adenins in
potenzieller Akzeptor, ebenso das O-4 des Thymins und das O-6
des Guanins; die Aminogruppen am C-6 des Adenins und am C-4
des Cytosins können als WSBB-Donatoren dienen
Vergleich der Furchen: A-DNA
- B-DNA
> in der A-DNA ist die große Furche größer, in B-DNA ist sind die
Furchen tiefer
An welcher Furche binden
sequenzspezifische Proteine?
> an der großen Furche, da diese mehr Merkmale zur
Unterscheidung eines Basenpaares von einem anderen aufweist
als die kleine
auch ist sie aufgrund ihrer Größe leichter zugänglich für
Wechselwirkungen mit Proteinen, die sequenzspezifische DNA
erkennen
Erkennungs- und
Spaltungsstelle von der EcoRVEndonuclease
> um die Spaltungsstelle herum: Symmetrie der Sequenz
die DNA ist verzerrt (nicht exakte B-Form) ->entweder durch das
Binden an ein Protein, oder es war schon vorher so
WSBB bieten die Spezifität der Erkennung-> Erkennung der Basen
durch WSBB in der großen Furche
das Auffälligste an dem Komplex ist die Verformung der DNA, die
in der Mitte deutlich geknickt wird
die mittleren beiden TA-Basenpaare in der Erkennungssequenz
sind bei der Entstehung des Knicks von entscheidender Bedeutung
-> sie treten nicht mit dem Enzym in Kontakt, sind aber offenbar
für diese Form erforderlich, weil sie sich leicht verformen lassen
die Sequenz 5’-TA-3’ gehört zu den am leichtesten verformbaren
Basenfolgen
würde sich die DNA nicht verformen lassen, so würde kein
Phosphat nah genug an die Aspartatreste des aktiven Zentrums
gelangen und es könnte sich keine vollständige
Magnesiumbindungsstelle bilden
Die Verformung des Substrats und die anschließende Bindung des
Magnesiumions sind für die hohe Spezifität verantwortlich
Vorteil, wenn DNA an
manchen Stellen gebogen ist
> bietet Möglichkeit für die spezifische Erkennung von Proteinen
Was machen AT-reiche
Sequenzen?
> tendieren dazu, von der B-Form der DNA abzuweichen -> Biegung
der DNA
Was verursacht eine Biegung?
> 4 oder mehr konsekutive Adenin-Reste
6 konsekutive Adenin-Reste?
> führen zu einer Biegung von 18°
Repressor
> als Repressor bezeichnet man ein Protein, welches an den
Operator der DNA bindet und damit die Bindung der RNAPolymerase
an den Promotor blockiert -> Verhinderung der
Transkription
Bsp: >Cro-Repressor Dimer des Phagen λ
Bindung der
Erkennungshelices α 3 in der
großen Furche
Glutamin bindet an Adenin
Besondere DNA-Strukturen
Palindrom, Mirror repeat, Hairpin, Cruciform (>stabile Schleifenstruktur -> besteht aus einem Strang
>als Doppelstrang: Cruciform (cross-like shaped DNA))
Triplex DNA
> zusätzliche WSBB mit funktionellen Gruppen in der großen Furche
(N7, O^6, N^6 der Purine: Hoogsteen Positionen)
Hoogsteen Basenpaarung
Bildung eines C-G-C+ Tripletts erfordert ein protoniertes Cytosin
Hoogsteen Paare
> Karst Hoogsteen
Erweiterung der Watson-Crick-Basenpaarung, indem sich noch
eine dritte Base anlagert -> 3-Strang-Struktur
tritt nur auf, wenn man lange Sequenzen von Adenin hat
G-Tetraplex/G-Quadruplex
> Nucleinsäuresequenzen, die besonders viel Guanin enthalten,
sind in der Lage, viersträngige Strukturen auszubilden
bestehen aus einer quadratischen Anordnung von
Guaninmolekülen, die von WSBB durch Ausbildung von Hoogsteen-
Paaren stabilisiert werden
zusätzlich werden sie durch ein monovalentes Kation (meist
Kalium) im Zentrum der Tetrade stabilisiert
nicht kanonische RNAStrukturen:
mRNA
> DNA von Eukaryoten ist primär im Nucleus der Zellen
Proteinsynthese findet am Ribosom im Cytoplasma statt
für der Transfer von genetischer Information wird ein messenger
Molekül gebraucht
RNA tritt im Nucleus und im Cytoplasma auf
mit zunehmender Proteinsynthese steigt der RNA- Level
RNA transportiert die genetische Information von der DNA zum
Ribosom -> mRNA
in Bakterien: polycistronisch (mehrere Gene auf 1 RNA)
in Eukaryoten: monocistronisch (1 Gen auf 1 RNA)
selbst-komplementäre
Sequenzen in einem RNAMolekül
> führen zur Bildung komplexer Strukturen
>G-C, A-U, aber auch G-U Basenpaare (hairpin, Bulle, internal loop)
Stem-loop structures
> treten auf, wenn zwei komplementäre Nukeotidsequenzen in
einer einzelsträngigen Nukleinsäure doppel-helikale Regionen
bilden
können komplett aus Watson-Crick-Paaren bestehen
dabei entstehen oft ‘‘mismatches’’ und ‘‘Ausbeugungen’’ ->
destabilisieren die lokale Struktur, aber können auch wichtig für
Faltungsmotive oder höhere Strukturen/ Funktionen sein
ungewöhnliches
Basenpaarungsmuster in tRNA
>gelegentlichtes Beiteiligen eines Phosphates oder einer 2'-OH Gruppe Bsp: Cytosin-Guanin-7-Methylguanin, Adenin-N^2-Dimethylguanin Adenin-Uracil-Adenin
Sekundärstruktur der RNA:
RNase P
> G-U-Basenpaare können nur vor der Faltung des soeben
synthetisierten RNA Stranges gebildet werden
es gibt keine RNA Polymerasen, die ein U gegen ein G ersetzen
würden
katalytische Aktivität der RNA
> Prozessierung der ribosomalen RNA in Tetrahymena
Self-Splicing eines Vorläufers der 26 S rRNA: ein Intron von 414 nt
wird von der RNA selbst herausgeschnitten
anschließend weitere Auto-Prozessierung, bis die katalytisch
aktive L19 RNA hergestellt wurde
katalytische Aktivität erfordert eine gut definierte 3D-Struktur!!!
Hammerhead Ribozyme
> tritt in genomischer RNA von Virusoiden auf
>der selbstspleißende RNA-Abschnitt erfordert Mg 2+!
DNA-Methylierung
> der Methylierungsgrad der DNA ist neben der Verpackung mit
Histonen ein weiterer Mechanismus, mit dem die für einen
bestimmten Zelltyp unpassende Genexpression unterdrückt
werden kann
das C-Atom 5 von Cytosin kann durch spezifische
Methyltransferasen methyliert werden
im Genom der Säugetiere sind rund 70 % - 90 % der 5’-CpG-3’
Sequenzen methyliert (dies entspricht 3% - 6% aller Cytosine)
die Methylgruppe des 5’-Methylcytosins ragt in die große Furche
und kann dort ohne weiteres die Bindung von Proteinen
beeinträchtigen, die stimulierend auf die Transkription wirken
in 40 % - 60 % aller menschlichen Gene sind CpG Inseln mit 5’-
regulatorischen Elementen assoziiert
Verteilung der CpG-Sequenzen
im Genom der Säugetiere
> die CpG-Sequenzen sind im Genom der Säugetiere nicht
gleichmäßig verteilt
viele CpG-Sequenzen wurden durch eine Mutation, das heißt
durch Desaminierung des 5-Methylcytosins zu Thymin, in TpGSequenzen
umgewandelt
die Stellen nahe am 5’-Ende der Gene blieben jedoch wegen ihrer Bedeutung für die Genexpression erhalten >deshalb findet man heute die meisten Gene in CpG-Inseln, Bereichen des Genoms, die rund viermal so viele CpG-Sequenzen enthalten wie das restliche Genom
Wie schützt eine Wirtszelle, die ein Restriktionsenzym enthält, ihre eigene DNA?
> Die Wirts-DNA wird an spezifischen Adeninbasen innerhalb der Erkennungssequenzen der Wirtszelle durch Methylasen geschützt >sobald ihre Erkennungssequenz in einem DNA-Molekül methyliert ist, spaltet die Restriktionsendonuclease diese DNA nicht mehr >für jede Restriktionsendonuclease erzeugt die Wirtszelle eine entsprechende Methylase, welche die Wirts-DNA an der entsprechenden Methylierungsstelle markiert -> Restriktions-Modifikations-Systeme
DNA-Methyltransferase
> übertragen Methylgruppen auf Nukleinbasen >Methylgruppendonor: SAM
Wie wird das Methylierungssingal gelesen?
> Transkriptionsfaktoren >Methyl-DNA-binding proteins >histon-modifizierende Enzyme
Methylierung von Cytosin an Prosition 5
Cytosin ————> 5-Methylcytosin
AdoMet —-> AdoHcy durch DNA-Methyltransferase
Was moduliert die DNA-Methylierung?
> Regulation der Genexpression >Organisation der Chomatinstruktur >Inatkivierung des X-Chromosoms >stabile Unterdrückung von Trasposons >zelluläre Differenzierung >Embryo Entwicklung >Cytosin-Methylierung von Gen-Promotoren unterdrückt die Transkription >Cytosin-Methylierung von codierenden Regionen in Genen hat einen geringen Einfluss auf die Gen-Expression >dynamische Prozesse
wie hoch ist der Proteinanteil eines Chromosoms?
50%
Chromatin
> DNA und alle Proteine, die an sie gebunden sind
Histone
> reich an basischen Aminosäuren wie Arginin und Lysin >bei allen Eukaryoten findet man 5 Hauptklassen von Histonen, die sich hinsichtlich Molekülmasse und Aminosäurezusammensetzung unterscheiden >die Histone H3 haben bei allen Eukaryoten fast die gleiche Aminosäuresequenz, das Gleiche gilt für H4 -> strenge Konservierung ihrer Funktion >Die Histone H1, H2A und H2B stimmen bei den verschiedenen Eukrayoten nicht so stark überein >jeder Histontyp kann durch Enzyme verändert werden: Methylierung, Acetylierung, ADP-Ribosylierung, Phosphorylierung, Glykosilierung,Sumoylierung, Ubiquitinierung >solche Abwandlungen beeinträchtigen die elektrische Gesamtladung, die Form und andere Eigenschaften der Histone ebenso wie die funktionellen und strukturellen Eigenschaften des Chromatins und die spielen eine Rolle bei der Regulation der Transkription
Nucleosomen
> jede Nucleosomenperle enthält 8 Histonmoleküle: je 2 Moleküle H2A, H2B, H3 und H4
zusammen mit der Verbindung zwischen der Perlen ergibt sich eine Wiederholungseinheit, die i.d.R.etwa 200 bp lang ist, wobei 146 bp dicht um den 8-teiligen Histonkern gebunden sind, während der Rest als Linker-DNA zwischen den einzelnen Nucleosomen dient
DNA ist 1,65 mal um Histonkomplex gewunden
das Histon H1 ist an die Linker-DNA gebunden
behandelt man Chromatin mit Enzymen, die DNA abbauen, so werden vorwiegend die Linker zerstört und es entstehen Histon-Partikel mit einer gebundenen DNA von jeweils 146 bp, die vor dem Abbau geschützt sind
diese Nukleosomenkerne kann man kristallisieren und es zeigte sich durch Röntgenstrukturanalyse, dass die DNA in Form einer linksgängigen Solenoidsuperspirale um die 8 Histonmoleküle gewunden ist
negativ superspiralisierte DNA um den Histonkern >positiv superspiralisierte DNA zwischen den Histonkernen >in den Linkern gibt es CG-reiche Sequenzen, die lokale Z-DNA bilden >die Linker zwischen den Histonkernen können durch Nukleasen gespalten werden, jedoch nicht die DNA, die mit den Histonkernen in Kontakt steht
ein weiterer Faktor, der die Bindung der DNA an die Histone des
Nukleosomenkerns beeinflusst, ist die Sequenz der gebundenen
DNA
Histonkerne binden nicht zufällig an DNA, sondern lagern sich an
bestimmte Stellen an (AT-reiche Sequenzen)
dies erleichtert die Komprimierung der kleinen Furche, die für
die feste Windung der DNA um den Histonkern notwendig ist
(über einen Arg-Rest)
Gemeinsamkeit der Histone
> die 3D Strukturen bestehen alle aus einer langen alpha-Helix, die
mit einem Loop verbunden ist und kürzeren Helices an jedem
Ende
Histon Octamer
> (H2A)2, (H2B)2, (H3)2, (H4)2
die Histone des Nukleosomenkerns oligomerisieren durch die
Bildung eines 4-Helix-Bündels
zwei (H2A-H2B)-Dimere wechselwirken mit (H3-H4) Tetramer
Bildung des Octamers
die basischen Reste der Histone wechselwirken mit dem Zucker-
Phosphat Rückgrat der DNA
Wie oft windet sich die DNA
um den Histon-Komplex?
1,65 mal
Die Rolle von H1
> H1 ist an der Außenseite gebunden
hat eine lange, helikale Struktur und ist basisch, aber untersch.
von der Octamerstruktur
wirkt wie eine Klemme, um die DNA zu fixieren
um welchen Faktor verkürzt
sich die DNA durch das
Winden um einen
Nukleosomenkern?
> um den Faktor 7
30 nm Faser
> dient der weiteren Verdichtung (100-fach)
erfordert pro Nukleosomenkern ein Molekül Histon H1
die Organisation der DNA in 30 nm Fasern erstreckt sich nicht
über das gesamte Chromosom, sondern ist von Abschnitten mit
sequenzspezifischen DNA-bindenden Nicht-Histon-Proteinen
unterbrochen
die 30 nm Struktur ist von der Transkriptionsaktivität des
jeweiligen DNA-Abschnitts abhängig ->Bereiche, in denen Gene
transkribiert werden, befinden sich anscheinend in einem weniger
geordneten Zustand und enthalten wenig oder gar kein Histon H1
Histone remodeling factors
> katalysieren das Hinzufügen oder Entfernen verschiedener
chemischer Elemente an Histone
beeinflusst die Bindungsaffinität zwischen Histonen und DNA
Histonmodifizierung:
Acetylierung von Lysin
> reduziert die positive Ladung der Histone
dadurch weniger kompakte Struktur
erhöhte Zugänglichkeit für Transkriptionsfaktoren
Signal wird z.B. durch ‘‘Chromatin-remodeling factors’’ erkannt
Histon-Acetyltranferasen
HATs
> Enzyme, die bestimmte Lysinreste acetylieren
während der Transkription wird das Histon H3 an Lys4 in
Nucleosome in der Nähe des 5’-Endes (N-terminal) der codierenden Region
methyliert sowie an Lys36 der gesamten codierenden Region
durch die Acetylierung mehrerer Lys-Reste in den
aminoterminalen Domänen der Histone H3 und H4 kann sich die
Affinität des gesamten Nucleosoms für DNA verringern
Histon-Deacetylasen (HDAC)
> ist die Transkription eines Gens nicht mehr erforderlich,
vermindert sich durch die Tätigkeit von HDACs die Acetylierung
der Nucleosomen in seiner Nachbarschaft im Rahmen eines
allgemeinen Genabschaltungsvorgangs, der das Chromatin wieder
in seinen inaktiven Zustand überführt
wie hängen Acetylierung und
Methylierung zusammen?
> reverse Prozesse
Methylierung von Lysin oder Arginin
> stabilisiert die kompakte Form der DNA (polare Interaktionen) ABER kann auch zur Inaktivierung durch sterische Hinderung führen. Abhängig von Position der Methylgruppe
kein Zugang für Transkriptionsfaktoren
Enzyme: Trothorax Proteine
Signal wird zB durch ‘‘Chromatin Remodeling Factors’’ erkannt
Signal wird durch Lysin-Demethylasen ausgeschaltet
Histon remodelling
RNA Pol II kann Nukleosom in DNA gebundenes Histonhexamer umwandeln. Nachdem RNA pol II weg ist Rückumwandlung zu Oktamer oder weiteres remodelling
Nukleosom Mobilisierung durch DNA-Translocating Enzyme (ATP)
DNA-Minor Groove Binder
> Netropsin A
Distamycin A
Cisplatin
selektiver Vorteil gegen Malaria: die DNA von Malaria Parasiten
hat mehr AT-reiche Sequenzen als die von Säugern -> Distamycin
und Netrospin haben im Minor-Groove eine AT-Präferenz und
inhibieren das Wachstum von plasmodium falciparum in Kultur
Netropsin A
> bindet an AT-reiche Sequenzen
>viele sind cytotoxisch -> Anti-Krebs-Therapie
Distamycin A
> cytotoxische Aktivität durch das Anheften von alkylierenden
Substanzen (z.B. Senfgas)
bindet sehr fest am Minor Groove -> kann nicht durch
Transkriptionsfaktoren repariert werden
Wechselwirkung von Tallimustin
mit dem DNA Duplex Tridecamer;
enthält die T4GA Konsensussequenz
Was ist ein Interkalator?
>flache, aromatische, planare Moleküle >lagern sich zwische Basenpaare ein >kann zur frame shift Mutation führen >ist der Interkalator flach genug, lagert er sich in die DNA und wirkt cytotoxisch
Acridin Orange
>Prototyp eines Interkalators >meistens auch cytotoxisch >manche werden gebraucht, um DNA im Labor zu färben (z.B. Ethidium Bromid) >Komplex zwischen Ethidium und 5-Iodo UpA
Daunorubicin
> sogar zwei Moleküle können sich
zwischen ein Basenpaar einlagern
Acridin Orange/cis-platinhybrid
> man kann auch Platin-Komponente einfügen
anfänglich: Interkalation
dann: Schneiden der DNA im Zucker-Phosphat-Rückgrat
Meselson Stahl Experiment
1957
a) >Zellen wurden über viele Generationen in einem Medium
gezüchtet, das ausschließlich schweren Stickstoff (15N) enthielt
>in ihrer DNA befand sich also ausschließlich 15N, sodass sich
nach der Cs-Cl-Dichtezentrifugation eine einzige Bande bildete
b) >nachdem die Zellen in ein Medium überführt wurden, das
ausschließlich leichten Stickstoff (14N) enthielt, wanderte die
nach einer Zellgeneration isolierte DNA in eine höhere Position im
Gradienten (violette Bande)
c) >nachdem die Replikation sich über eine weitere Generation
fortgesetzt hatte, waren zwei Hybrid-DNAs
(violett) und zwei leichte DNAs (rot), die
ausschließlich 14N DNA enthielt,
entstanden
>damit war bestätigt, dass die Replikation
semikonservativ ist
John Cairns
> Autoradiographie
er ließ E coli Zellen in einem Medium mit Thymidin wachsen, das mit Tritium (H3) markiert war, sodass die Zellen radioaktiv wurden
nachdem er die DNA isoliert, ausgebreitet und mit einer
fotographischen Schicht überzogen hatte, auf die er die
Radioaktivität mehrere Wochen einwirken ließ, erzeugte das Thymidin ‘‘Spuren’’ aus Silberkörnern in einer Emulsion, sodass sich ein Bild des DNA-Moleküls ergab
die Spuren zeigten, dass das unversehrte Chromosom von E. coli ein einziger großer Ring von 1,7 mm Länge ist
die radioaktive DNA, die während der Replikation aus den Zellen isoliert wurde, war als eine zusätzliche Schleife zu erkennen
daraus zog Cairns den Schluss, dass die Schleife auf die Bildung zweier radioaktiver Tochterstränge zurückzuführen war, die jeweils zu einem Ausgangsstrang komplementär waren
ein Ende oder beide Enden der Schleife sind
Replikationsgabeln, bewegliche Stellen, an denen die Ausgangs-DNA entwunden wird und die Stränge schnell repliziert werden
damit hatte Cairns nachgewiesen, dass beide Stränge der DNA gleichzeitig repliziert werden
eine Abwandlung seines Experiments wies darauf hin, dass die
Replikation von Bakterienchromosomen in beiden Richtungen
verläuft, also bidirektional ist: an beiden Enden der Schleife
befinden sich aktive Replikationsgabeln
Bidirektionale Replikation
sichtbar gemacht
> wenn man Tritium 3H nur für kurze Zeit zusetzt und die Reaktion
dann abbricht, findet man die Markierung (rot) an einer oder an
beiden Replikationsgabeln
das hier dargestellte Autodiagramm zeigt die Replikationsblase
bei B. subtilis
der Bereich der größten Dichte an Silberkörnern
(Pfeile) befindet sich an den beiden Enden, wo
die Replikation stattfindet
der nichtreplizierende Bereich des Chromosoms
außerhalb der Blase ist nicht markiert und daher
nicht sichtbar
Richtung der DNA Synthese
> neue Stränge werden immer in 5’-3’-Richtung synthetisiert
da die beiden Stränge antiparallel angeordnet sind, wird der als
Matrize dienende Strang vom 3’ zum 5’ Ende hin abgelesen
am kontinuierlichen Strang (leading strand) läuft die 5’-3’-
Synthese in gleicher Richtung wie die Replikationsgabel
auf dem diskontinuierlichen Strang (lagging strand) läuft die 5’-
3’-Synthese entgegen
der Bewegung der
Replikationsgabel ->
OKAZAKI-Fragmente
DNA-Syntheseprozess
> grundlegende Reaktion: Phosphorylgruppentransfer
das Nucleophil ist die 3’-OH Gruppe des Nucleotids am 3’-Ende
des wachsenden Stranges
dieses greift den α- Phosphor des hinzukommenden
Desoxynucleosid-5’-triphosphats nucleophil an
bei der Reaktion wird anorganisches Pyrophosphat frei
die Reaktion verläuft mit einer nur geringen Änderung der freien
Enthalpie, da eine Phosphodiesterbindung auf Kosten einer etwas
weniger stabilen Phosphoanhydridbindung gebildet wird
die Entstehung des Produktes wird begünstigt, weil das Enzym
Pyrophosphatase anschließend das Pyrophosphat hydrolisiert,
wobei Energie frei wird
Was benötigt die DNAPolymerase?
> Primer
>Matrize
Primer
> Das zu verlängernde Anfangssegment eines Polymers, von dem
die Elongation abhängt
Matrize
> Eine DNA- oder RNA-Sequenz, welche die Synthese einer
komplementären Sequenz steuert
Klenow-Fragment
> das Fragment enthält zwei Hauptteile des vollständigen Enzyms
einer davon ist die Polymeraseeinheit, die ungefähr wie eine
rechte Hand geformt ist und deren Domänen man als Finger,
Handfläche und Daumen bezeichnet
neben der Polymerase gehört zum Klenow-Fragment noch eine
Domäne mit 3’->5’ Exonuclease Aktivität, die eine
Korrekturlesefunktion übernimmt
Klenow Fragment der DNA-Pol I
von E coli (T-Steitz)
Mechanismus der DNAPolymerase
> im aktiven Zentrum sind zwei Metallionen vorhanden
das eine geht eine koordinative Bindung zur 3’-OH Gruppe des
Primers ein, während das andere nur mit dem dNTP interagiert
die Phosphatgruppe des NTPs bildet eine Brücke zwischen den
beiden Metallionen
die OH-Gruppe des Primers wird durch
das Metallion aktiviert und greift die α-
Phosphatgruppe an, sodass eine neue OP-
Bindung entsteht
die beiden Metallionen bilden einen
Komplex mit den Carboxylgruppen von
zwei Aspartatresten in der
Handflächendomäne der Polymerase
die Seiteketten halten die Ionen in der
richtigen Lage und Orientierung fest
Aufgaben der Aspartatreste
> Deprotonierung (Aktivierung)
>die Metallionen in Position halten
Warum akzeptiert die DNA Pol I nur 2’-Deoxynukleotide?
> ein Phenylalanin und ein Glutamat hinter dem ankommenden
dNTP lassen keinen Platz für eine 2’-OH-Gruppe -
die sterische Hinderung wäre zu groß
(Pre-check #1)
Wechselwirkungen an der
kleinen Furche
> DNA-Polymerasen wirken ggü. den Basenpaaren in der kleinen
Furche als Donatoren für zwei Wasserstoffbrücken
an den betreffenden Positionen stellen alle Watson-Crick-
Basenpaare
Wasserstoffbrückenakzeptoren bereit
im Innern des Enzyms nimmt die DNA
die A-Form an, da hier die kleine Furche
zugänglicher ist
(Pre-check #3)
Spezifität der Replikation
> die Bindung eines dNTP an die DNA-Polymerase löst eine
Konformationsänderung aus
die Fingerdomäne dreht sich und bildet eine enge Tasche, in die nur ein richtig geformtes Basenpaar ohne Weiteres hineinpasst
die Konformationsänderung ist nur dann möglich, wenn es sich bei den dNTP um den Watson-Crick-Partner der Base in der Matrize handelt
falsche dNTPs können nicht stark am aktiven Zentrum
der DNA Pol binden ->sie werden ausgeschlossen,
bevor die Phosphodiesterbindung
gebildet werden kann
(Pre-check #2)
Korrekturlesefunktion der
Polymerase
> fungiert als 3’-5’-Exonuclease
wenn eine falsche Base eingebaut wird, verlangsamt sich die
DNA-Synthese aufgrund der Schwierigkeiten, die auftreten, wenn
ein Nicht-Watson-Crick-Paar durch die Polymerase gefädelt wird
darüber hinaus ist die fehlgepaarte Base nur schwach gebunden
und daher an ihrer Position beweglich
durch die Verzögerung besteht genügend Zeit, damit sich der
neu synthetisierte Strang aus dem aktiven Zentrum der
Polymerase hinaus in das aktive Zentrum der Exonuclease hinein
bewegt
dort wird die DNA abgebaut, ein Nucleotid nach dem anderen,
bis sich der DNA-Strang zurück in das aktive Zentrum der
Polymerase bewegt und die Synthese fortgesetzt wird
andere DNA-Polymerasen:
DNA Pol I
> 90 % der Polymeraseaktivität in E coli
fügt 600 Nukleotide/Minute hinzu -> geringe Prozessivität
‘‘cleaning up’’; 5’->3’ Exonukleaseaktivität und 3’ -> 5’ Exonukleaseaktivität
andere DNA-Polymerasen:
DNA Pol III
> Hauptreplikationsenzym von E coli
andere DNA-Polymerasen:
DNA Pol II, IV, V
> DNA Reparatur
Nick-Translation
> bei diesem Vorgang wird ein mit einer DNA-Matrize gepaarter DNA- oder RNA-Strang von der 5’->3’-Exonukleaseaktivität der DNA-Pol I abgebaut und durch die Polymeraseaktivität desselben Enzyms ersetzt
beide Aktivitäten sind von Bedeutung für die DNA-Reparatur und die Entfernung der RNA-Primer bei der DNA-Replikation
grün: Nucleinsäurestrang, der entfernt wird (DNA oder RNA); rot: der ihn ersetzende Strang
am Beginn der DNA-Synthese steht ein
‘‘Nick’, d.h. ein Einzelstrangbruch mit einem freien 3’-OH und einem 5’-Phosphat
die Pol I verlängert den zur Matrize
komplementären Strang und verschiebt
den Nick dabei an der DNA entlang (daher
Nick-Translation)
wenn sich die Pol von der DNA löst,
bleibt der Nick zurück und wird von
einem anderen Enzym geschlossen
DNA Pol III Holoenzym und
Helikase von E coli
> die DNA-Doppelhelix vor der Polymerase wird durch eine
hexamere Helikase entwunden, die man als DnaB bezeichnet
Kopien von SSB Proteinen binden an die entwundenen Stränge und halten sie voneinander getrennt, sodass sie als Matrizen dienen können
der Leitstrang wird kontinuierlich von der Pol III synthetisiert
die Topoisomerase II führt gleichzeitig negative Superspiralen ein, um topologische Probleme zu
vermeiden
die Synthese des Folgestranges erfolgt in Koordination mit der Synthese des Leitstranges -> wie ist das möglich?
das Holoenzym umfasst zwei Kopien des Core-Enzyms der Polymerase
das Core-Enzym besteht aus der eigentlichen DNA-Polymerase
(der α-Untereinheit), der ԑ-Untereinheit
(einer 3’->5’-Exonuklease als Korrekturlesefunktion), einer
weiteren Untereinheit mit der Bezeichnung θ sowie zwei Kopien der dimeren β-Untereinheit, die die gleitende Klammer bildet
die Core Enzyme sind mit einer zentralen Struktur gekoppelt, die die Untereinheitenstruktur γτ2δδ’χφ besitzt
die γτ2δδ’-Struktur ist der clamp loader Komplex
die χφ-Untereinheiten treten mit dem SSB in WW
der gesamte Proteinkomplex interagiert mit der hexameren Helikase DnaB
die Matrize des Folgestranges wird zu einer Schleife gebogen, sodass die Matrize in einer der Untereinheiten der DNA-Pol III in derselben Richtung läuft (5’->3’) wie die Matrize des Leitstranges in der anderen Untereinheit
nach ca. 1000 Nukleotiden lässt die DNA-Pol III die Matrize des Folgestranges los, indem das Klammerprotein freigesetzt wird
es bildet sich eine neue Schleife, eine neu gleitende Klammer tritt hinzu, und die Primase synthetisiert wieder einen kurzen RNA-Primer um die Bildung eines weiteren OKAZAKI-Fragments zu beginnen
diese Art der Replikation bezeichnet man als Posaunenmodell, da sich die Schleife wie der Außenzug bei einer Posaune verlängert und verkürzt
die Lücken zwischen den Fragmenten des neu gebildeten Folgestranges werden durch die DNA Pol I aufgefüllt; außerdem entfernt es mit seiner 5’->3’Exonukleaseaktivität auch die Ribonukleotidprimer, der von dem Polymerasezentrum liegt
der Primer kann nicht von der DNA-Pol III beseitigt werden, da diesem Enzym die Fähigkeit zur 5’->3’-Korrektur fehlt
schließlich verbindet die DNA-Ligase die einzelnen Fragmente
Enzyme und Proteinfaktoren in der DNA Replikation
> die Replikation in E coli beinhaltet über 20 verschiedene Enzyme und andere Proteine
Replikasekomplex oder Replisom
die Trennung der Elternstränge: Helicase >Strangtrennung: topologische Spannung -> release durch Topoisomerase
Stabilisierung der getrennten Stränge: SSB
Synthese der Primer: Primasen
Entfernung der Primer und Ersetzen durch DNA: 5’->3’-Exonukleaseaktivität der DNA-Pol I
3 Stufen: Initiation, Elongation, Termination
ähnlich der Biosynthese von RNA und Proteinen
Regulation der DNAReplikation
> die Initiation ist der einzige Teil der DNA-Replikation, der
reguliert wird
Die Replikation findet nur einmal pro Zellzyklus statt
dabei spielt die Methylierung der DNA ihre WW mit dem
Cytoplasma eine wichtige Rolle
Dam-Methlase methyliert N6 der Adenine in palindromischen 5’-GATC Sequenzen im OriC
es gibt 11 5’-GATC Sequenzen im OriC (sonst nur 1 in 256 bp)
sofort nach der Replikation ist der oriC hemimeythliert
dann WW mit der Plasmamembran
anschließend komplette Methylierung durch Dam Methylase
DUE
> DNA-unwinding element
der OriC von E.coli: enthält Sequenzelemente, die in allen Oris von Bakterien gefunden wurden
3 Sequenzen mit 13 bp und 4 Sequenzenmit 9 bp
mind. 9 verschiedene Proteine sind beteiligt
GATC wird methyliert durch die Dam Methylase am N6 von Adenin
AT-reich
durch Hemimethylierung kann man bei Reparatur zwischen den beiden Strängen unterscheiden
AAA+-ATPasen
> ATPases associated with diverse cellular activities
viele davon (auch DnaA und DnaC) hydrolisieren ATP relativ langsam zu ADP und unterziehen sich einer konformationellen Änderung; sie tendieren auch dazu, Oligomere zu bilden
8 DnaA Moleküle (alle an ATP gebunden) binden an 4
Wiederholungen
die DNA windet sich um diesem Komplex, wodurch eine
rechtshändige helikale Struktur entsteht
die AT-Region wird dadurch in den 13 bp Wdh denaturiert
(erfordert ATP und das Protein HU (histonelike Protein))
die hexamere Helicase DnaB bindet an die getrennten Stränge
(unterstützt durch DnaC)
HU-Dimer
> Bindung der dsDNA durch die beiden Arme
>kleines, basisches, hitzestabiles Protein
PcrA
> Helicase von Bacillus thermophilus (4 Domänen)
A1 bindet ATP (P loop)
A1 und B1 binden ssDNA
PcrA ist ein Monomer,
viele andere Helikasen
(zB DnaB) sind Multimere
Verbrauch: ein ATP pro entwundenes Nukleotid
Mechanismus der PcrA (und
auch anderer Helikasen)
> die Domänen A1 und B1 binden an ssDNA in der Abwesenheit von ATP
das Binden von ATP verursacht eine konformationelle
Neuanordnung und das Schließen der Lücke zwischen A1 und B1
folglich wird die WW zwischen A1 und ssDNA geschwächt
anschließend wird ATP zu ADP und P hydrolisiert -> die Lücke zwischen A1 und B1 öffnet sich wieder
nun hat A1 eine höhere Affinität zu ssDNA als B1
-> A1 zieht somit die DNA an sich heran -> Translokation
Konservierung der Helikasen
> Sequenzvergleich mit anderen Helikasen zeigt, dass 7 Regionen konserviert werden
diese sind an ATP-Bindung oder ssDNA Bindung beteiligt
replikative Helikase des
Bakteriophagen T7
> ATP ist zwischen den Untereinheiten lokalisiert
>die Helikase arbeitet als eine molekulare Maschine (ähnlich der PcrA von B. stearothermophilus)
Wozu führt
Superspiralisierung?
> ein superspiralisiertes Molekül ist viel kompakter als ein
entspanntes der gleichen Länge
eine superspiralisierte DNA bewegt sich bei der Zentrifugation oder Elektrophorese schneller als entspannte DNA
Verwindungszahl Lk (linking number)
> definiert als die Anzahl der Rechtswindungen eines DNAStranges um die in einer Ebene gelegene Helixachse
Topoisomere
> Moleküle, die sich nur in der Verwindungszahl unterscheiden
können nur durch Schneiden eines oder beider Stränge
ineinander überführt werden
rechtsgängige Helix
> negative Zahl (negative supercoiling)
wird Lk erniedrigt, so führt dies sowohl zu einer rechtsgängigen
(negativen) Superspiralisierung der DNA-Achse als auch zur Entwindung der Doppelhelix
linksgängige Helix
> positive Zahl (positive supercoiling)
Typ I Topoisomerasen
> katalysieren in einer thermodynamisch begünstigten Reaktion die Entspannung von superspiralisierter DNA
schneiden nur einen Strang
Typ II Topoisomerasen
> nutzen die durch ATP-Hydrolyse gewonnene Energie, um
negative Superspiralen in DNA-Moleküle einzuführen
schneiden beide Stränge
Mechanismus Topoisomerase I
> die DNA bindet im Hohlraum der Topoisomerase
die OH-Gruppe des Tyr 723 greift die Phosphatgruppe in einem Strang des DNA-Rückgrats an und bildet eine
Phosphodiesterbindung zwischen Enzym und DNA, wobei die DNA gespalten wird und eine freie 5’-OH Gruppe entsteht
nachdem nun das Rückgrat des einen Stranges gespalten ist, kann die DNA um den zweiten Strang frei rotieren
angetrieben wird die Drehung durch die Freisetzung der Energie, die in der Superspiralisierung gespeichert war
durch die Rotation der DNA werden die Superspiralen
entwunden
das Enzym kontrolliert die Rotation so, dass die Entwindung nicht zu schnell von statten geht
die freie OH Gruppe der DNA greift den Phosphotyrosinrest an,
sodass das Rückgrat wieder verbunden und das Tyrosin freigesetzt wird
nun kann sich die DNA ungehindert vom Enzym lösen
der Vorgang führt dazu, dass sich ein superspiralisiertes Plasmid ganz oder teilweise entspannt
Mechanismus Topoisomerase II (DNA Gyrase)
> da ein superspiralisiertes Molekül im Gegensatz zu seinem
entspannten Gegenstück unter Torsionsspannung steht, erfordert seine Entstehung den Aufwand von Energie
Topo II Enzyme sind Dimere mit zwei inneren Hohlräumen
der größere Hohlraum hat oben und unten jeweils ein Tor, das für die Wirkung des Enzyms von entscheidender Bedeutung ist
eine Doppelhelix (G-Segment) bindet an das Enzym
jeder Strang wird dabei neben einem Tyrosin aus einem der beiden Monomere positioniert und zwar so, dass es eine kovalente Bindung zum Rückgrat der DNA ausbilden kann
der Komplex bindet dann locker an eine zweite DNA-Doppelhelix
(T-Segment)
jedes Monomer des Enzyms besitzt eine ATP-bindende Domäne
die Bindung von ATP (2) führt zu einer Konformationsänderung, welche die Annäherung der beiden Domänen stark begünstigt
indem die Domänen näher zusammenrücken, halten sie das gebundene T-Segment fest; gleichzeitig sorgt die Konformationsänderung dafür, dass die beiden Stränge des G-Segments getrennt und gespalten werden
jeder dieser beiden Stränge wird dann über eine Tyrosinphosphodiesterbindung am Enzym festgehalten >nun wandert das T-Segment durch das gespaltene G-Segment hindurch in den großen zentralen Hohlraum
anschließend führt die Ligation des G-Segments dazu, dass das T-Segment durch das Tor am unteren Ende des Enzyms entlassen wird
durch die Hydrolyse von ATP (2) sowie die Freisetzung von ADP und Orthophosphat können sich die ATP-bindenden Domänen trennen und das Enzym auf die Bindung eines neuen T-Segments vorbereiten
der gesamte Vorgang führt dazu, dass die Verwindungszahl um den Wert 2 abnimmt
Gyrasehemmer
> die Topoisomerase II der Bakterien (DNA-Gyrase) dient als Angriffspunkt für mehrere Antibiotika, die das prokaryotische Enzym wesentlich stärker hemmen als das eukaryotische
Novobiocin blockiert die Bindung des ATP an die Gyrase >Ciproflaxin beeinträchtigt die Spaltung und Wiedervereinigung der Ketten ->beide werden zur Behandlung von Harnwegsinfektionen eingesetzt
Inhibitoren der eukaryotischen Topoisomerase II
> Doxorubicin, Etoposid
beeinträchtigen entweder die Spaltung der Doppelhelix oder verhindern die Wiedervereinigung der Stränge -> Protein-verknüpfte DNA-Brüche
E coli Primase
> DnaG RNA Polymerase
verantwortlich für die Synthese der RNA-Primer für die ssDNA
hat 5 Domänen: Zink-bindende Domäne, katalytische Domänen (bestehen aus 3 Subdomänen), Helikase (DnaB)-bindende Domäne
das katalytische Zentrum enthält mehrere negativ geladene saure Reste (Asp, Glu) -> Mg2+-Ionen
->teilweise Neutralisation der negativen Ladung
in vielen Organismen sind die Helikase und die Primase kovalent verbunden (Phage T7)
Problem bei der Lagging Strand Synthese
> Für jedes Okazaki Fragment wird neue clamp benötigt
Anhäufung von benutzten β-clamps
300-600 Clamps pro Zelle, aber ca 4000 OKAZAKI Fragmente
Lösung: Entladung benutzter Clamps durch DnaX Komplex oder die δ-Untereinheit des DnaX-Komplexes (clamp loading complex = γ complex)
Clamp Komplexe mit anderen Proteinen werden vor Entladung geschützt, nur bereits benutzte Clamp werden entladen
Clamp loading: Interaktion zwischen δ und β sorgt dafür dass sich β-β um 15 A öffnet
Prozessivität der Polymerase
Anzahl der Nukleotide die angeheftet wurden bevor die Polymerase von Template fällt
Ligase
> die DNA-Ligase braucht eine freie OH-Gruppe am 3’-Ende der einen DNA-Kette und eine Phosphatgruppe am 5’-Ende der anderen
Energiequelle erforderlich: Eukaryoten und Archaeen: ATP; Bakterien: NAD+
DNA-Ligase kann nicht zwei Moleküle einer einzelsträngigen DNA zum Ring schließen; sie schließt vielmehr Brüche in doppelsträngigen DNA-Molekülen Mechanismus:
Adenylierung (Hinzufügen eines AMP) der ԑ-Aminogruppe eines Lysin-Rests im aktiven Zentrum des Enzyms -> Bildung eines kovalenten Enzym-Adenylat-Komplexes (über Phosphoamidbindung) ->das ist die Aktivierung des Enzyms!
das AMP wird auf das 5’-Phosphat des DNA-Moleküls übertragen, um die Phosphatgruppe zu aktivieren -> DNA-Adenylat Komplex
nucleophiler Angriff des 3’-OH auf das aktivierte Phosphat -> Bildung einer Phosphodiesterbindung (AMP ist gute Abgangsgruppe, evtl Mg2+ als Katalysator für Ligase-Reaktion)
Termination der DNA - Replikation in E coli
> am Ende treffen sich die beiden Replikationsgabeln des ringförmigen E.coli Chromosoms in einem Terminationsbereich, der mehrere Exemplare einer 20 bp langen Sequenz namens Ter enthält
die Ter Sequenzen bilden auf dem Chromosom eine Art Falle, die die Replikationsgabel erreichen, aber nicht mehr verlassen kann
sie dienen als Bindungsstelle für das tus Protein (terminus utilization substance)
der Komplex aus tus und ter kann nur die aus einer Richtung ankommende Replikationsgabel festhalten (verhindert weiteres Entwinden durch Helikase–>nicht essentiell)
in jedem Replikationszyklus ist nur ein solcher Komplex aktiv - nämlich der erste, auf den eine der beiden Replikationsgabeln trifft
trifft eine der beiden Replikationsgabeln auf den tus-ter-Komplex, so bleibt sie stehen; die andere kommt zum Stillstand, wenn sie auf die erste (bereits entstehende) Gabel trifft
Mechaninsmus des Tus/Ter-Komplexes
> das Replisom bewegt sich auf dem DNA Strang entlang und nähert sich Tus an
die Helicase DnaB unterstützt die Primase (DnaG) in der Synthese eines letzten Folgestrang-Primers
DnaB wird von Tus blockiert und dissoziiert von dem Strang
DNA-Pol III Holoenzym vervollständigt die Synthese des Leistranges bis zum tus-ter-Komplex und synthetisiert ebenfalls des letzte OKAZAKI Fragment auf dem Folgestrang
das Holoenzym dissoziiert und hinterlässt eine Y-geformte Struktur, welche aus ssDNA auf dem Folgestrang besteht
Trennung der verketteten Ringe nach Terminierung der Replikation
> Zur Trennung der verketteten Ringe (Catenane) ist eine Typ II Topoisomerase erforderlich: T-Segment fällt durch das Loch der Topoisomerase, Tyrosin-OH-Gruppe bindet kovalent an Phosphat –> Intermediat Tyrosinseitenkette mit DNA (EINZIGER FALL DNA+PROTEIN)
die getrennten Chromosomen verteilen sich dann bei der Zellteilung auf die Tochterzellen
4 Phasen des eukaryotischen
Zellzyklus
> M-Phase: Mitose und Zellteilung (Zytokinese) -> relativ kurz
G1-Phase: ‘‘gap’’ -> Zellwachstum -> längste Phase
S Phase: ‘‘Synthese’’ -> DNA-Synthese
G2-Phase: die tetraploide Zelle wird für die Mitose vorbereitet;
Chromosomenkondensation in G1, G2; G0 Phase: Ausruhphase
Kontrolle des Zellzyklus
> DNA Synthese erfolgt nur in der S-Phase
in der G2-Phase wird die DNA zur Replikation vorbereitet
Regulation? -> für jede Phase eines Zellzyklus gibt es bestimmte Cycline
Cycline sind an Kinasen geknüpft
für jeden Zyklus existiert eine best. cyclinabh. Kinase
durch Cycline und cyclinabhängige Kinasen (CdKs)
Cycline werden während einer Phase des Zellzyklus hergestellt und während der nächsten Phase komplett verbraucht
jedes Cyclin bindet an eine spezifische CdK und aktiviert sie
anschließend phosphoryliert die CdK spezifische Zielproteine, die dann ihre Aufgabe im jeweiligen Zustand des Zellzyklus erledigen können
die ‘‘Check Points’’ müssen passiert worden sein, bevor der Zellzyklus in die nächste Phase eintreten kann
CdK2 bindet an ORC (‘‘origin-recognition-complex’’) und
verknüpft damit den Zellzyklus an die DNA Replikation
-> DNA Synthese wird hier initiiert
Welche drei DNA-Polymerasen
werden für die eukaryotische
Replikation benötigt?
> DNA-Polymerase α
DNA-Polymerase δ
DNA-Polymerase ԑ
DNA-Polymerase α
> tritt ausschließlich im Nucleus auf
nimmt teil an der Replikation chromosomaler DNA in 5’-3’-
Richtung (an einem ssDNA Template)
hat keine Exonukleaseaktivität
Prozessivität: nur 100 Nukleotide ca.
dicht mit der Primase assoziiert -> Komplex namens Pol
α/Primase
synthetisiert RNA Primer von 7-10 Nukleotiden
diese werden durch 15 Desoxynukleotide erweitert
spezifischer Inhibitor: Aphidicolin
DNA-Polymerase δ
> wird auch durch Aphidicolin inhibiert
keine Assoziation mit der Primase
hat eine 3’-5’ Exonuklease Aktivität -> Proofreading >Prozessivität: extrem hoch, aber nur assoziiert mit PCNA >PCNA=proliferating cell nuclear antigen
PCA kommt im Nucleus vor und in proliferierenden Zellen >reagiert mit Antikörpern, die in Patienten gebildet werden, die unter der Autoimmunkrankheit systemischer Lupus leiden
Struktur PCNA
> Trimer ( β-2 Clamp ist nur ein Dimer)
Struktur ähnelt der des β 2 Clamp von E coli Pol III
β 2 ist jedoch ein Homodimer, während PCNA aus 3 identischen Untereinheiten besteht
die Sequenz von E.coli Pol III β 2 und PCNA ähnelt sich nicht!!!
PCNA bildet eine ringförmige Klammer, die die Prozessivität der Polymerase erheblich steigert -> Beispiel, dafür, dass die 3D Struktur in der Evolution besser konserviert wird als die Aminosäuresequenz
DNA-Polymerase ԑ
> wird auch durch Aphidicolin inhibiert
keine Assoziation mit der Primase
hat eine 3’-5’ Exonuklease Aktivität -> Proofreading
diese Exonukleaseaktivität schneidet Hexa- oder Heptanukleotide des wachsenden Leitstranges, keine einzelnen Nukleotide
Pol ԑ scheint eine Leitstrang Synthetase zu sein
RFC
> Replikationsfaktor C
Folgestrang:
Entfernung des Pol-α/Primase vom Template-Strang -> Polymerasewechsel
hilft PCNA, die Klammer auszubilden und erleichtert den Zusammenbau aktiver Replikationskomplexe
die Untereinheiten des RFC-Komplexes haben eine signifikante Sequenzähnlichkeit zu den Untereinheiten des bakteriellen clamp loading γ Komplexes ->RFC lädt PCNA auf den Template Strang an eine Position in der Nähe der Primer
anschließend bindet Pol δ an PCNA und erweitert den Primer mit hoher Prozessivität
RFC hat die gleiche Aufgabe wie die beta-Untereinheit (clamp loader) in E coli
Pol δ /PCNA
> notwendig für die Lagging-Strand Synthese
> Polymerase Exchange Mechanismus
Pol ԑ
> notwendig für die Leading-Strand-Synthese
MCM
> Helikase >besteht aus 6 Untereinheiten (2-7) >Mini Chromosome Maintenance
Primerentfernung durch FEN1
> Flap (etwa 10 Nukleotide RNA7DNA am 5’-Ende des stromabwärts liegenden Okazaki Fragments werden durch Pol δ entfernt, wenn diese die Synthese des aktuellen Okazaki-Fragments abschließt)
FEN1 (Flap-endonuclease 1) schneidet den flau an der y-förmigen Kreuzung mit der Duplex-DNA –> Lücke wird durch DNA Ligase I geschlossen
3 FEN1-Moleküle binden an PCNA-Trimer
RPA
> Replication Protein A
eukaryotsiches SSB
Heterotrimer
Pol γ
> tritt nur im Mitochondrium auf
Pol βηικζ
> DNA Reparatur
Pol β
> kleines Enzym (nu 335 Aminosäurereste)
nimmt die Form einer offenen rechten Hand an (wie viele andere
Polymerasen auch)
Replikationsursprung in
Eukaryoten
> eukaryotische Zellen replizieren die DNA mit einer
Geschwindigkeit von 50 Nukleotiden/sek -> 20 mal langsamer als E.coli
ein eukaryotisches Chromosom enthält ca. 60 mal mehr DNA als ein prokaryotisches -> bidirektionale Replikation würde über einen Monat dauern
multiple Ursprünge -> autonom replizierende Sequenzen (Arsch) oder ‘‘Replikatoren’’ -> ein pro 3-300 kb -> S Phase dauert ein paar Stunden
Ein Replikationsurprung in der
Hefe
> hexamere DNA Helikase -> die Beladung der DNA mit der replikativen Helikase ist das Schlüsselereignis für die Initiation der Replikation
bei der Helikase handelt es sich um einen heterohexameren Komplex aus MCM-Proteinen (minichromosome maintenance)
Cdc6 Protein (Cell division cotrol protein 6)
die charakteristischen Boxen im Ursprung werden nur schwach konserviert zwischen den verschiedenen Organismen
Zusammensetzung des
eukaryotischen
Initiationskomplexes
> die Cycline werden am Ende der M-Phase (Mitose) schnell durch eine ubiquitinvermittelte Proteolyse abgebaut -> die Abwesenheit von Cyclin erlaubt die Bildung von präreplikativen Komplexen (prä-RCs) an
den Stellen, an denen die Replikation initiiert wird
durch die Bildung von prä-RCs ist die Zelle
bereit für die Replikation, ein Zustand, der auch als
Lizensierung bezeichnet wird
der prä-RC kann die DNA - Replikation nicht initiieren -> ist nur während der S-Phase aktiv
die temporäre Trennung stellt sicher, dass jeder
Replikationsursprung nur einmal während eines Zellzyklus die DNA Replikation initiieren kann
ORC = ‘‘origin recognition complex’’
Hexamer von Orc1 - Orc6 ->bindet an den Urpsrung -> nimmt Cdc6 + Cdc1 auf (in Hefe) -> Bindungs des MCM Komplexes von Mcm2 - Mcm7 an die DNA - > MCM ist die Helikase
all diese Proteine (außer Cdt1) sind ATPasen der AAA Familie (wie auch DnaA, DnaB und DnaC)
Phosphorylierung ist wichtig, um sicherzustellen, dass die
Replikation an den Zellzyklus gekoppelt ist
Kopplung der DNA-Synthese an
den Zellzyklus
> die Origins of Replications bilden einen Komplex namens ORC (Origin-of-replication complex)
zusätzlich gibt es eine hexamere Helikase (MCM Komplex (MCM 2-7))
Protein Cdc 6 (aus de Hefe) -> Helikase loading factor -> bindet an die Boxen
in E coli gibt es drei Kopien dieser Boxen (mit
GATC Sequenz)-> methyliert an der exozyklischen Gruppe von Adenin
die Proteine, die dort binden, sind DnaA und DnaC >bereits in der G Phase sind die Origins markiert als Origins
der ORC Komplex bindet an die Boxen und die DNA windet sich um diesen Komplex in einer kleinen Schleife -> alles ist vorbereitet, aber es kann noch nicht ‘‘gefeuert’’ werden
erst wenn die S Phase des Zellzyklus erreicht ist, kommen Cdk2 und Cdc6 dazu >Phosphorylierung des Cdc6 durch Cdk2 und Phosph. der Helikase(Cdc 45-MCM-GINS) an einer Untereinheit -> Pre-RC Komplex kann ‘‘feuern’’
dann kann der MCM Komplex binden, wird ebenfalls phosphoryliert -> Initiation kann beginnen
Warum funktioniert die MMC nicht in vitro?
> MMC Helikase hat in vitro nicht funktoniert -> erst mit Cdc45 und GINS (‘‘go-ichi-ni-san’’)
Cdc45-MCM-GINS - Helikase
RPA=replication protein A; ATR = DNA damage kinase(checks for DNA damage–> can switch on cascade so that replication stops until damage is fixed)
FCP fork protection complex
Was macht HIV?
> Human immunodeficiency virus
tötet viele der infizierten Zellen (v.a. T-Lymphozyten)
führt dazu, dass das Immunsystem des Wirtsorganismus immer stärker unterdrückt wird
die Reverse Transkriptase ist sehr fehleranfällig -> hohe Mutationsrate
die Reverse Transkriptase gelangt zusammen mit dem einzelsträngigen RNA-Genom des Virus in die Wirtszelle >dort katalysiert sie als Erstes die Synthese eines DNA-Stranges, der zur viralen DNA komplementär ist >anschließend baut sie den RNA-Strang des Hybrids aus viraler RNA und DNA ab und ersetzt ihn durch DNA
der so entstandene DNA-Doppelstrang wird häufig in das Genom der eukaryotischen Wirtszelle eingebaut
Chromatin remodeling factors
> Wenn Replikationsgabel das Nukleosom passiert, dissoziiert das Histonoktamer zu einem (H3-H4)2 Tetramer und zwei H2A-H2B Dimere
H3-H4 bleibt lose an einen Tochterstrang gebunden, H2A-H2B dissoziiert komplett
neu synthetisiertes H3-H4 wird eingesetzt, neues und altes H2A-H2B bildet mit ihm Komplexe–> Oktamer
Histonchaperone (= chromatin-assembly factors)
Vermehrungszyklus des HIV
Adsorption - reverse Transkription - Ringbildung - Integration - Transkription - Translation - Proteinspaltung - Zusammenbau und Ausschleusung
3 Aktivitäten der Reversen
Transkriptase
> RNA-directed DNA Polymerase
RNase H
DNA-directed DNA Polymerase
