Bio mol Flashcards
E.coli est quoi
- bactérie hôte de tram- résidente du tractus intestinal de souche K-12, MG1655, DH5 alpha et HB101 qui est une souche de labo non pathogène à croissance rapide et excellent pour le clonage ainsi que pour contenir des plasmides
Mini-prep
- 1 à 5 ml de culture de départ
- 30 à 100 ug d’ADN récolté
Midi-prep
- 15 à 35 ml de culture de départ
- 100 à 350 ug d’ADN récolté
Maxi-prep
- 100 à 200 ml de culture de départ
- 500 à 800 ug d’ADN récolté
Pourquoi utiliser de l’antibiotique dans la culture de départ ?
- éviter la perte du plasmide
- éviter contamination de la culture
pourquoi o/n culture départ ?
- pour avoir beaucoup de cellules en fin de phase exponentielle
pourquoi sous-agitation
- homogénéité des nutriments et fait une hausse d’oxygène dans la culture
incubation à T° ?
37°C –> t° optimale
centrifugation récolte ?
séparer bactéries du milieu de culture qui pourrait empêcher réactifs de bien fonctionner
Décrire étapes de extraction AN plasmique
1- culture départ (mis dans milieu culture et mis à incubation)
2- récolte des bactérie par centrifugation pour les séparer du milieu de culture
3- éliminer le surnageant par transcodage et ensuite par pipetage
4- resuspendre culot dans du tampon de resuspension R3 avec RNase A jusqu’à homogénéité
5 - vortexes pour que l’ADN soit en contact avec cellules et que la slt soit en contact avec les cellules
6- ajout du tampon de lyse L7
7- mélanger par inversion
8- incuber à RT pour 5 minutes
9- ajouter le tampon de précipitation N4
10- mélanger par inversion pour ne pas briser l’ADN
11- crentrifuger
12- charger une colonne placée dans un microbe stérile avec surnageant
13- mettre à la centrifugeuse
14- éliminer surnageant microtome
15 - laver colonne avec le tampon de lavage W9 avec Éthanol 96-100%
16- centrifuger et éliminer surnageant microtome
17- centrifuger et jeter le microtube et placer colonne dans nouveau microtube
18- Ajout de tampon TE et incubation de une minute
19- centrifugation
20- élimination colonne et conservation ADN purifié
21- conserver à 4°C ou aliquote à -20°C
rôle tampon R3
- attaque et fragilise paroi cellulaire
- avec Tris-Cl et EDTA = acide éthylène diamine tétraacétique ( un agent chélateur des cations divalents qui va former des complexes métalliques très stables qui vont déstabiliser la paroi)
- ## RNase qui dégrade les ARN simple brin contaminant suite à la lyse
rôle tampon de lyse L7 et ses différents composants
et avantages
- libération ADN situé dans le cytoplasme de la bactérie
– SDS = dissout les membranes cellulaires
– NaOH = sépare les paires de bases (ponts H entre les paires de bases) et dénaturation de l’ADN chromosomique linéaire
- n’a pas d’effets sur les plasmides parce que les brins ne peuvent pas se séparer à cause qu’il est circulaire et super enroulé donc protégé
la lyse dépend de …
la taille du plasmide, la souche bactérienne,
les manipulations à effectuer
Lyse cellulaire - enzymatique
- pour les gros plasmides
- la méthode gentille parce qu’elle minimise les forces physiques requises pour libérer le ou les plasmides de l’int. pressurisé de la bactérie
- Lysozyme = enzyme qui dégrade protéines paroi. –> lysozyme + EDTA + sucres = sphéroplastes = cellules sans parois
- SDS = pour lyse, détergent qui dissous membrane
lyse cell - thermique
- chaleur
- -> pas recommandé pour souches E.coli qui possèdent l’enzyme(non désactivée) qui dégraderait l’ADN extrait en présence de Mg++
lyse cell- mécanique
par ultrasons (bonifications) qui rompt les membranes cellulaires
étape 7 : pourquoi mélanger par inversion ?
- parce que la lyse fait une suspension visqueuse par la présence d’ADN dans le surnageant et les débris cell. dans le culot
- Il ne faut pas briser l’ADN
étape 8 : pourquoi respecter incubation ?
- expo. prolongée ADN plasmique superenroulé au NaOH ou chaleur peut causer dénaturation donc il faut respecter temps incubation (pas trop long)
- laisser le temps à slt agir sur cellules
À quoi sert la solution 3 ; le tampon de précipitation N4 et ses composants
- chlorhydrate de guanidine (GuHCl) –> agent chaotropique : briser les ponts hydrogènes de van der Waals et hydrophobes afin de dénaturer les protéines (dissocier les nucléoprotéines et inhiber les RNases), interrompre les liens d’ADN et eau
but des colonnes et volume tot
- fixer ADN dans une colonne de résine de silice
- 850 ul
comment l’ADN se fixe-t-il à la résine de silice
par affinité grâce à l’importance du pH et de la concentration de sel
et par le fait que le GuHCL préalablement ajouté à l’ADN est + et que la silice est chargée négativement
à quoi sert le tampon de lavage W9 + EtOH
- enlever impuretés comme protéines et sel
- enlever sels chaotropiqeus du tampon N4 – permet avoir ADN de haute pureté
Qu’est ce que laver (étapes) ?
- enlever surnageant
- ajout de solution de lavage (saline, tampon, alcool)
- resuspendre ou mélanger
- centrifuger une deuxième fois
- éliminer surnagent
À quoi sert le tampon TE et ses composants ?
- tris
- EDTA = agent chélateur, se complexe avec le Mg++, qui forme un complexe métallique très stable et qui bloque l’activité de nbr nucléases dépendantes ion Mg++
- solubiliser ADN en protégeant dégradation
Comment doser de l’ADN
1- allumer le spectro au moins 15 min av. utilisation
2- diluer l’ADN 1/10 ou 1/100 dans du tampon TE stériles pcq sinon trop [ ] et avoir le moins d’ADN possible (m^ tampon que celui de conservation)
3- ajouter qté dans cuvette faire t- avec juste tampon TE
4- prendre D.O. à 260-280 nm
5- calculer [ ] ADNdb avec formule = D.O x 50 x F.D.
6- calculer ratio D.O. 260/D.O. 280 pour avoir pureté
catégories de pureté
- 1,8 = excellent = adn
- < 1,6 = contamination protéines et phénol
- > 2 = contamination ARN
quantité de ug/ml de db qu’on veut
ADNdb = ~ 50 ug/ml ARNsb = ~ 40 ug/ml Oligosb = ~ 20 ug/ml
Étapes digestion ADNp
1- identifier microtube et sortir solutions mélanger et placer sur glace (H20, tampon 10x, enzyme)
2- placer volume d’eau nanopure dans microtube (20ul - reste ingrédients)
3- ajouter tampon 10x et mélanger par aspiration explosion avec p-20
4- Ajouter solution ADN extrait et mélanger par aspire expire
5- Ajouter 4 U de EcoRI (~ 2 ul)
6- incuber à 37°C o/n
7- arrêter digestion en congelant à -20°C
ordre solutions et vol. tot. ?
eau –> tampon digestions –> ADN –> enzyme
20 ul
- diluer avec quoi ?
- tampon approprié à enzyme et jamais dans l’eau parce que peut causer dénaturation et baisse efficacité
concentration ADN - digestion ?
- d’habitude fait en fonction de la concentration que tu connais
pourquoi aspirer-expirer ?
avoir slt homogène donc [ADN] homogène
Enzyme EcoR1
- Escherichia coli
- 5’- G/ AATTC - 3’
- 3’ - CTTAA/ G - 5’
- conserver à -20°C
- 20 000 U/ml
temps incubation enzyme - digestion
- grande [ ] = temps diminué
- petite [ ] = temps augmenté
arrêter réaction digestion
- congeler à -20°C
- ajout de 0,5 M EDTA pH 8,0 pour [ ] finale de 10 mM
- extraction phénolique
- chauffer
Étape protocole électrophorèse
1- prep suffisamment de tampon TAE 1X pour remplir chambre et préparer le gel, à partir de sol stock TAE 50X
2- dissoudre au micro-onde et laisser refroidir
3- Ajouter le GelRED
4- placer le support de gel dans la cellule pour bloquer les côtés ouverts du support
5- ajouter peigne
6- verser solution refroidie d’agarose pour avoir gel de 35 mm épaisseur uniforme
7- laisser figer pour 30-45’ RT
8- enlever délicatement peigne
9-orienter correctement gel (ADN va vers anode)
10- ajouter assez de tampon migration TAE 1X pour submerger gel ~ 1 mm
11- mélanger échantillons (eau, tampon, échantillon)
12- ajouter le volume dans les puits
13- brancher couvercle de la chambre dans bonne orientation
14 - laisser migrer jusqu’à distance appropriée
15 - fermer courant et enlever gel
16- regarder et analyser gel
Tampon TAE
- tris-acide acétique- EDTA
- le + utilisé
- migration plus rapide
- meilleure résolution pour ADN superenroulée
- surtout pour gros fragments > 20 kb
- idéal si récupérer des bandes (donc de L’ADN)
tampon TBE
- tris acide borique EDTA
- plus coûteux
- capacité tampon superieure
- pour petits fragments plus petite que 1 kb = meilleure résolution
tampon alcalin
pour ADNsb
stock 50x
- diluer à 1x pour faire gel et remplir chambre
- m^ numéro lot pour gel et chambre
Gel Red
- agent intercalant de l’ADN
- fluorophore (exposition aux UV = couleur orangée)
- structure similaire au EtBr
- EtBr
bromure d’éthidium
- s’intercale entre les pb de l’ADNdb
- observation sous rayons UV
- mutagène/cancérigène/tératogène : gants de nitrile + lunettes + visière
- déchets toxiques ds poubelle spéciale
avantages GelRed
- plus sécuritaire que EtBR pour l’environnement/santé
- ultra sensible (plus que EtBr)
- stable en slt en T°C pièce
- simple d’utilisation
- pas de rinçage nécessaire
- comptabilité avec les matériaux standards et applications informatiques
désavantage geler
- coût au dessus de 2000$ pour 10 ml
- photosensible
type d’agarose
- différent niveau de pureté
- point de fusion différent : une diminution du melting point donne une meilleure résolution et de plus petits fragments
- electrophoresis grade
la concentration d’agarose
= différentes porosité
- solution d’agarose dans tampon TAE ou TBE 1X
relation linéaire entre le lot de mobilité ADN et [agarose]
il y aune migration inversement proportionnelle au long du nombre de pb d+’ADN linéaire, la longueur des fragments d’ADNdb linéaires dépend de la concentration d’agarose du milieu
