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Biotech > Bio mol > Flashcards

Bio mol Flashcards

1
Q

E.coli est quoi

A
  • bactérie hôte de tram- résidente du tractus intestinal de souche K-12, MG1655, DH5 alpha et HB101 qui est une souche de labo non pathogène à croissance rapide et excellent pour le clonage ainsi que pour contenir des plasmides
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Q

Mini-prep

A
  • 1 à 5 ml de culture de départ

- 30 à 100 ug d’ADN récolté

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Q

Midi-prep

A
  • 15 à 35 ml de culture de départ

- 100 à 350 ug d’ADN récolté

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4
Q

Maxi-prep

A
  • 100 à 200 ml de culture de départ

- 500 à 800 ug d’ADN récolté

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5
Q

Pourquoi utiliser de l’antibiotique dans la culture de départ ?

A
  • éviter la perte du plasmide

- éviter contamination de la culture

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6
Q

pourquoi o/n culture départ ?

A
  • pour avoir beaucoup de cellules en fin de phase exponentielle
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7
Q

pourquoi sous-agitation

A
  • homogénéité des nutriments et fait une hausse d’oxygène dans la culture
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8
Q

incubation à T° ?

A

37°C –> t° optimale

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9
Q

centrifugation récolte ?

A

séparer bactéries du milieu de culture qui pourrait empêcher réactifs de bien fonctionner

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10
Q

Décrire étapes de extraction AN plasmique

A

1- culture départ (mis dans milieu culture et mis à incubation)
2- récolte des bactérie par centrifugation pour les séparer du milieu de culture
3- éliminer le surnageant par transcodage et ensuite par pipetage
4- resuspendre culot dans du tampon de resuspension R3 avec RNase A jusqu’à homogénéité
5 - vortexes pour que l’ADN soit en contact avec cellules et que la slt soit en contact avec les cellules
6- ajout du tampon de lyse L7
7- mélanger par inversion
8- incuber à RT pour 5 minutes
9- ajouter le tampon de précipitation N4
10- mélanger par inversion pour ne pas briser l’ADN
11- crentrifuger
12- charger une colonne placée dans un microbe stérile avec surnageant
13- mettre à la centrifugeuse
14- éliminer surnageant microtome
15 - laver colonne avec le tampon de lavage W9 avec Éthanol 96-100%
16- centrifuger et éliminer surnageant microtome
17- centrifuger et jeter le microtube et placer colonne dans nouveau microtube
18- Ajout de tampon TE et incubation de une minute
19- centrifugation
20- élimination colonne et conservation ADN purifié
21- conserver à 4°C ou aliquote à -20°C

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11
Q

rôle tampon R3

A
  • attaque et fragilise paroi cellulaire
  • avec Tris-Cl et EDTA = acide éthylène diamine tétraacétique ( un agent chélateur des cations divalents qui va former des complexes métalliques très stables qui vont déstabiliser la paroi)
  • ## RNase qui dégrade les ARN simple brin contaminant suite à la lyse
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12
Q

rôle tampon de lyse L7 et ses différents composants

et avantages

A
  • libération ADN situé dans le cytoplasme de la bactérie

– SDS = dissout les membranes cellulaires

– NaOH = sépare les paires de bases (ponts H entre les paires de bases) et dénaturation de l’ADN chromosomique linéaire

  • n’a pas d’effets sur les plasmides parce que les brins ne peuvent pas se séparer à cause qu’il est circulaire et super enroulé donc protégé
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13
Q

la lyse dépend de …

A

la taille du plasmide, la souche bactérienne,

les manipulations à effectuer

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14
Q

Lyse cellulaire - enzymatique

A
  • pour les gros plasmides
  • la méthode gentille parce qu’elle minimise les forces physiques requises pour libérer le ou les plasmides de l’int. pressurisé de la bactérie
  • Lysozyme = enzyme qui dégrade protéines paroi. –> lysozyme + EDTA + sucres = sphéroplastes = cellules sans parois
  • SDS = pour lyse, détergent qui dissous membrane
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15
Q

lyse cell - thermique

A
  • chaleur
  • -> pas recommandé pour souches E.coli qui possèdent l’enzyme(non désactivée) qui dégraderait l’ADN extrait en présence de Mg++
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16
Q

lyse cell- mécanique

A

par ultrasons (bonifications) qui rompt les membranes cellulaires

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17
Q

étape 7 : pourquoi mélanger par inversion ?

A
  • parce que la lyse fait une suspension visqueuse par la présence d’ADN dans le surnageant et les débris cell. dans le culot
  • Il ne faut pas briser l’ADN
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18
Q

étape 8 : pourquoi respecter incubation ?

A
  • expo. prolongée ADN plasmique superenroulé au NaOH ou chaleur peut causer dénaturation donc il faut respecter temps incubation (pas trop long)
  • laisser le temps à slt agir sur cellules
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19
Q

À quoi sert la solution 3 ; le tampon de précipitation N4 et ses composants

A
  • chlorhydrate de guanidine (GuHCl) –> agent chaotropique : briser les ponts hydrogènes de van der Waals et hydrophobes afin de dénaturer les protéines (dissocier les nucléoprotéines et inhiber les RNases), interrompre les liens d’ADN et eau
20
Q

but des colonnes et volume tot

A
  • fixer ADN dans une colonne de résine de silice

- 850 ul

21
Q

comment l’ADN se fixe-t-il à la résine de silice

A

par affinité grâce à l’importance du pH et de la concentration de sel
et par le fait que le GuHCL préalablement ajouté à l’ADN est + et que la silice est chargée négativement

22
Q

à quoi sert le tampon de lavage W9 + EtOH

A
  • enlever impuretés comme protéines et sel

- enlever sels chaotropiqeus du tampon N4 – permet avoir ADN de haute pureté

23
Q

Qu’est ce que laver (étapes) ?

A
  • enlever surnageant
  • ajout de solution de lavage (saline, tampon, alcool)
  • resuspendre ou mélanger
  • centrifuger une deuxième fois
  • éliminer surnagent
24
Q

À quoi sert le tampon TE et ses composants ?

A
  • tris
  • EDTA = agent chélateur, se complexe avec le Mg++, qui forme un complexe métallique très stable et qui bloque l’activité de nbr nucléases dépendantes ion Mg++
  • solubiliser ADN en protégeant dégradation
25
Q

Comment doser de l’ADN

A

1- allumer le spectro au moins 15 min av. utilisation
2- diluer l’ADN 1/10 ou 1/100 dans du tampon TE stériles pcq sinon trop [ ] et avoir le moins d’ADN possible (m^ tampon que celui de conservation)
3- ajouter qté dans cuvette faire t- avec juste tampon TE
4- prendre D.O. à 260-280 nm
5- calculer [ ] ADNdb avec formule = D.O x 50 x F.D.
6- calculer ratio D.O. 260/D.O. 280 pour avoir pureté

26
Q

catégories de pureté

A
  • 1,8 = excellent = adn
  • < 1,6 = contamination protéines et phénol
  • > 2 = contamination ARN
27
Q

quantité de ug/ml de db qu’on veut

A 
ADNdb = ~ 50 ug/ml 
ARNsb = ~ 40 ug/ml
Oligosb = ~ 20 ug/ml
28
Q

Étapes digestion ADNp

A

1- identifier microtube et sortir solutions mélanger et placer sur glace (H20, tampon 10x, enzyme)
2- placer volume d’eau nanopure dans microtube (20ul - reste ingrédients)
3- ajouter tampon 10x et mélanger par aspiration explosion avec p-20
4- Ajouter solution ADN extrait et mélanger par aspire expire
5- Ajouter 4 U de EcoRI (~ 2 ul)
6- incuber à 37°C o/n
7- arrêter digestion en congelant à -20°C

29
Q

ordre solutions et vol. tot. ?

A

eau –> tampon digestions –> ADN –> enzyme

20 ul

30
Q
  • diluer avec quoi ?
A
  • tampon approprié à enzyme et jamais dans l’eau parce que peut causer dénaturation et baisse efficacité
31
Q

concentration ADN - digestion ?

A
  • d’habitude fait en fonction de la concentration que tu connais
32
Q

pourquoi aspirer-expirer ?

A

avoir slt homogène donc [ADN] homogène

33
Q

Enzyme EcoR1

A
  • Escherichia coli
  • 5’- G/ AATTC - 3’
  • 3’ - CTTAA/ G - 5’
  • conserver à -20°C
  • 20 000 U/ml
34
Q

temps incubation enzyme - digestion

A
  • grande [ ] = temps diminué

- petite [ ] = temps augmenté

35
Q

arrêter réaction digestion

A
  • congeler à -20°C
  • ajout de 0,5 M EDTA pH 8,0 pour [ ] finale de 10 mM
  • extraction phénolique
  • chauffer
36
Q

Étape protocole électrophorèse

A

1- prep suffisamment de tampon TAE 1X pour remplir chambre et préparer le gel, à partir de sol stock TAE 50X
2- dissoudre au micro-onde et laisser refroidir
3- Ajouter le GelRED
4- placer le support de gel dans la cellule pour bloquer les côtés ouverts du support
5- ajouter peigne
6- verser solution refroidie d’agarose pour avoir gel de 35 mm épaisseur uniforme
7- laisser figer pour 30-45’ RT
8- enlever délicatement peigne
9-orienter correctement gel (ADN va vers anode)
10- ajouter assez de tampon migration TAE 1X pour submerger gel ~ 1 mm
11- mélanger échantillons (eau, tampon, échantillon)
12- ajouter le volume dans les puits
13- brancher couvercle de la chambre dans bonne orientation
14 - laisser migrer jusqu’à distance appropriée
15 - fermer courant et enlever gel
16- regarder et analyser gel

37
Q

Tampon TAE

A
  • tris-acide acétique- EDTA
  • le + utilisé
  • migration plus rapide
  • meilleure résolution pour ADN superenroulée
  • surtout pour gros fragments > 20 kb
  • idéal si récupérer des bandes (donc de L’ADN)
38
Q

tampon TBE

A
  • tris acide borique EDTA
  • plus coûteux
  • capacité tampon superieure
  • pour petits fragments plus petite que 1 kb = meilleure résolution
39
Q

tampon alcalin

A

pour ADNsb

40
Q

stock 50x

A
  • diluer à 1x pour faire gel et remplir chambre

- m^ numéro lot pour gel et chambre

41
Q

Gel Red

A
  • agent intercalant de l’ADN
  • fluorophore (exposition aux UV = couleur orangée)
  • structure similaire au EtBr
42
Q
  • EtBr
A

bromure d’éthidium

  • s’intercale entre les pb de l’ADNdb
  • observation sous rayons UV
  • mutagène/cancérigène/tératogène : gants de nitrile + lunettes + visière
  • déchets toxiques ds poubelle spéciale
43
Q

avantages GelRed

A
  • plus sécuritaire que EtBR pour l’environnement/santé
  • ultra sensible (plus que EtBr)
  • stable en slt en T°C pièce
  • simple d’utilisation
  • pas de rinçage nécessaire
  • comptabilité avec les matériaux standards et applications informatiques
44
Q

désavantage geler

A
  • coût au dessus de 2000$ pour 10 ml

- photosensible

45
Q

type d’agarose

A
  • différent niveau de pureté
  • point de fusion différent : une diminution du melting point donne une meilleure résolution et de plus petits fragments
  • electrophoresis grade
46
Q

la concentration d’agarose

A

= différentes porosité

- solution d’agarose dans tampon TAE ou TBE 1X

47
Q

relation linéaire entre le lot de mobilité ADN et [agarose]

A

il y aune migration inversement proportionnelle au long du nombre de pb d+’ADN linéaire, la longueur des fragments d’ADNdb linéaires dépend de la concentration d’agarose du milieu

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