Bakterie- morfologia i metody barwienia Flashcards
1
Q
Wielkość (wymiary) bakterii- ogólnie:
UWAGA!!!
Nowo odkryte gatunki na przykład (x1) ……………………. są kilkaset razy większe od bakterii przeciętnej wielkości i mogą być widziane już gołym okiem
A
Większość od 1 do kilku mikrometrów
np. Thiomargarita namibiensis
2
Q
1 mikrometr ile to metrów
A
10 do potęgi -6 metra
3
Q
Najmniejsze bakterie- podaj rodzaj bakterii i wielkość
A
Mycoplasma i riketsje -> 0,15 do 0,2 mikrometra
4
Q
Największe bakterie- podaj rodzaj bakterii i wielkość
A
Spirillum -> ponad 40 mikrometrów
5
Q
Typy morfologiczne bakterii- ze względu na kształt:
A
Wyróżniamy 4 typy bakterii:
- kuliste (owalne)
- cylindryczne
- spiralne
- nitkowate
6
Q
Bakterie kuliste (owalne) to: x5
A
dwoinki ( Neisseria ) tetrady ( Micrococcus ) czworaczki i sześcianki ( Sarcina ) gronkowce ( Staphylococcus ) paciorkowce ( Streptococcus )
7
Q
Bakterie cylindryczne to: x5
A
pałeczki (np. Escherichia coli) laseczki ( Bacillus, Clostridium ) maczugowce ( Corynobacterium ) prątki ( Mycobacterium ) wrzecionowce ( Fusobacterium )
8
Q
Bakterie spiralne to: x3
A
śrubowce ( Spirillum )
przecinkowce ( Vibrio )
krętki ( Leptospira, Borrelia, Treponema )
9
Q
Bakterie nitkowate to: x2
A
Actinomyces
Nocardia
10
Q
Różnice między Eukaryota a Prokaryota
A
-Komórki zwierząt, roślin i grzybów określane są mianem eukariontów
-bakterie i niebieskozielone glony
(sinice) należą do prokariontów
- Komórki prokariotyczne różnią się od eukariotycznych: -brakiem jądra i niektórych organelli
-chromosomami
-> chromosom typowej bakterii (takiej jak Escherichia coli) jest:
pojedynczą
dwuniciową
kolistą cząsteczką (DNA)- zawierającą ok 5 milionów par zasad o długości 1,3 mm
najmniejsze chromosomy bakteryjne (np. mykoplazm) są 4 razy krótsze
**Dla porównania – ludzie posiadają:
dwie kopie 23 chromosomów, których
długość wynosi 990 mm, a liczba par zasad to aż 2,9 × 10 do potęgi 9
11
Q
Rybosomy bakteryjne są mniejsze/ większe od rybosomów komórek eukariotycznych
A
mniejsze
12
Q
u większości bakterii występuje podobna w swej strukturze do gęstego sita, peptydoglikanowa:
A
ściana komórkowa otaczająca błony i chroniąca je przed czynnikami środowiskowymi
13
Q
Bakterie potrafią / nie potrafią przeżyć w nieprzyjemnych warunkach środowiska
A
potrafią przeżyć a w niektórych przypadkach nawet
wzrastać w nieprzyjaznym środowisku
(np. zew. ciś.osmotycznym tak niskim, że doprowadziłoby ono do lizy większość komórek eukariotycznych)
Bakterie potrafią przetrwać także w ekstremalnie wysokich i niskich temperaturach, w warunkach suszy i w obecności bardzo nikłych źródeł energii
14
Q
Dlaczego bakterie potrafią przetrwać w ekstremalnie wysokich i niskich temperaturach i w warunkach suszy i w obecności bardzo nikłych źródeł energii??
A
Bo wykształcają struktury i mechanizmy pozwalające im na adaptację do takich warunków
15
Q
Bakterie wstępnie identyfikuje się przez analizę ich wzrostu na charakterystycznych podłożach selekcyjnych
A
kolor rozmiar kształt zapach zdolność do rozkładu cukrów( np. laktozy -rozróżnienie między E. coli a Salmonella ) zdolność do lizy erytrocytów- hemoliza zdolność do hydrolizy tłuszczów (np. lipaza Clostridium). oporność na określone antybiotyki
16
Q
Mikroskopu używa się w mikrobiologii do
dwóch głównych celów:
A
1) wstępnego wykrycia drobnoustrojów
2) wstępnej lub ostatecznej identyfikacji drobnoustrojów
17
Q
Badanie mikroskopowe próbek materiału klinicznego jest stosowane do wykrywania:
A
komórek bakteryjnych
form morfologicznych grzybów, pasożytów (jaja, larwy, postaci dorosłe)
wtrętów wirusowych obecnych w zainfekowanym
materiale
18
Q
Metody mikroskopowe: x5
A
a) Mikroskopia jasnego pola (świetlna)
b) Mikroskopia ciemnego pola
c) Mikroskopia kontrastowo-fazowa
d) Mikroskopia fluorescencyjna
e) Mikroskopia elektronowa
19
Q
Mikroskopia jasnego pola (świetlna)
A
- źródło światła
2.kondensor skupia światło na preparacie
3.system dwóch soczewek (soczewka obiektywu
i soczewka okularu) - powiększenie obrazu jest pochodną
powiększenia soczewki obiektywu i okularu
5.trzech różnych soczewki obiektywu:
>małej mocy (powiększenie x10) do przeglądania próbki
>dużej mocy (powiększenie x40) do poszukiwania dużych drobnoustrojów jak pasożyty i grzyby strzępkowe
>bardzo dużej mocy z użyciem immersji olejowej (100xpowiększenie) do obserwowania bakterii,
drożdży i szczegółów morfologicznych większych organizmów i komórek - Ograniczeniem jest rozdzielczość obrazu (zdolność do rozróżnienia, że dwa obiekty są odrębne i nie są jednym)
- Zdolność rozdzielcza większa, gdy olejek
immersyjny umieszczony między soczewką obiektyw a preparatem, bo olejek redukuje dyspersję światła - Najlepsze mają zdolność rozdzielczą o wartości w przybliżeniu 0,2 µm - zobaczenie większości bakterii, ale NIE WIRUSÓW
20
Q
Mikroskopia ciemnego pola:
A
- system dwóch soczewek (soczewka obiektywu
i soczewka okularu)
2.używa się specjalnego kondensora (lub kondensora pokrytego olejkiem immersyjnym)- zapobiega
bezpośredniemu oświetlaniu preparatu
3.preparat jest podświetlony na jasno w ciemnym tle - lepsza zdolność rozdzielcza (0,02 µm w porównaniu z 0,2 µm)
- struktury wewnętrzne drobnoustrojów nie
mogą być obserwowane, bo światło przechodzi wokół niż przez drobnoustroje
- struktury wewnętrzne drobnoustrojów nie
21
Q
Mikroskopia kontrastowo-fazowa:
A
- badanie szczegółów budowy wew. drobnoustrojów + obraz 3D
- równoległe wiązki światła przechodzą przez obiekty o różnej gęstości wiązka przechodząca przez bardziej gęsty materiał jest opóźniona bardziej niż druga wiązka
3.pierścieniowehobwódki w kondensorze i soczewce obiektywu - światło w obserwowanym obiekcie wydaje
się jaśniejsze niż poza nim
22
Q
Mikroskopia fluorescencyjna:
A
- niektóre drobnoustroje wykazują naturalną fluorescencję (autofluorescencja)
- związki zwane fluorochromami mogą absorbować
światło ultrafioletowe lub ultraniebieskie o krótkiej długości fali i emitować energię w postaci światła widzialnego o większej długości fali - używa się wysokociśnieniowych lamp rtęciowych, halogenowych lub ksenonowych, które emitują światło o krótszej fali
- preparaty wybarwione: podświetlone na jasno na ciemnym tle => duży kontrast
23
Q
Mikroskopia elektronowa:
A
- w mikroskopach elektronowych używane są cewki magnetyczne (zamiast soczewek)
- cewki magnetyczne kierują wiązkę elektronów z włókna wolframowego przez preparat na ekran
- znacznie krótsza fala światła= powiększenie i rozdzielczość są znacznie lepsze
- preparaty barwione lub pokryte jonami metali
w celu stworzenia kontrastu - dwa rodzaje mikroskopów elektronowych: ->ELEKTRONOWY MIKROSOP TRANSMISYJNY
elektrony tak jak światło przechodzą bezpośrednio przez preparat
>MIKROSKOP ELEKTRONOWY SKANINGOWY
elektrony odbijają się od pow. preparatu
pod kątem i powstaje obraz trójwymiarowy powierzchni
obiektu
24
Q
Metody badawcze / barwienia:
A
- badanie bezpośrednie
- różnicujące
- barwienie w kierunku bakterii kwasoopornych
- fluoroscencyjne
25
badanie bezpośrednie cechy:
odmiana badania bezpośredniego to + cechy:
1. proste do przygotowania
2.> próbka= preparat natywny (przyżyciowy) + KOH
albo
>próbka= preparat natywny (przyżyciowy) + KOH + barwnik kontrastujący ( laktofenol, jod )
3. barwnik wzmacnia kontrast w stosunku do tła
4. szczegółowe badanie struktur
KOH używany jest w celu rozpuszczenia materiału białkowego i ułatwienia detekcji elementów grzybów, które nie są niszczone przez silne roztwory zasadowe. Aby zwiększyć kontrast między elementami grzybów a tłem można dodać barwniki, takie jak laktofenol
odmiana to metoda z tuszem chińskim (India ink)
- tusz zaciemnia tło
- pozostawiając komórkę niezabarwioną
- do wykrywania otoczek organizmów grzybów drożdżopodobnych Cryptococcus
- Barwnik używany głównie do wykrywania Cryptococcus spp. w płynie mózgowo-rdzeniowym i innych płynach ciała
26
Barwienie różnicujące:
1. barwienia określonych składników materiału komórkowego
2. różne metody:
>Barwienie metodą Gram: bakterie gram+ i gram- oraz grzyby drożdżopodobne (są Gram+)
>Hematoksylina żelazowa:
pierwotniaków pasożytnicze w kale
>barwienie trójkolorowe: alternatywa dla barwienia hematoksyliną żelazową
```
>barwienie metodą Wrighta-Giemsy
-do wykrywania pierwotniaków krwi
-ciałek wtrętowych wirusów
-mikroorganizmów z rodzaju: Chlamydia,
Borellia, Toksoplazma, Pneumocystis i Rickettsia
```
>srebrem do wykrywania elementów grzybów i bakterii w tkance
>błękitem toluidyny O do wykrywania Pneumocystis w próbkach z układu oddechowego
27
Barwienie metodą Grama:
podstawę do wydzielenia
głównych grup bakterii bakterie gram+ i gram- oraz grzyby drożdżopodobne (są Gram+)
1.Po utrwaleniu próbki na szkiełku
mikroskopowym (przez podgrzewanie lub stosowanie alkoholu), nanoszony jest fiolet krystaliczny
2. dodawana jest jodyna (płyn Lugola) w celu wytworzenia kompleksu z podstawowym barwnikiem. 3. Kolejno podczas odbarwiania alkoholem lub acetonem kompleks jest zatrzymywany w bakteriach Gram+, ale eliminowany w Gram-
4. Następnie kontrastowe barwienie safraniną lub fuksyną uwidacznia się w organizmach Gram-ujemnych
(czerwony kolor)
Stopień, w jakim mikroorganizm pozostanie wybarwiony zależy
od typu drobnoustroju, warunków posiewu i umiejętności osoby wykonującej barwienie.
28
1. Barwienie w kierunku bakterii kwasoopornych:
1. zachowują barwnik w komórce, nawet po zastosowaniu silnych czynników odbarwiających
2. trzy różne metody barwienia:
>Metoda Ziehl-Neelsena:
- wymaga podgrzewania próbki
- do barwienia mykobakterii
- organizmy te są czerwone na jasnoniebieskim tle
>metoda Kinyouna:
- jak metoda Ziehl-Neelsena
- ale nie wymaga podgrzewania !!!
>metoda auramina-rodamina
-barwniki fluorescencyjne
>Zmodyfikowane
barwienie w kierunku
kwasooporności:
- słaby czynnik odbarwiając
- odbarwiają się np. Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Gordonia, Cryptosporidium, Isospora, Sarcocystis i Cyclospora
29
Barwienie fluoroscencyjne:
1. Rodzaje:
>Barwienie auraminą-rodaminą
>Barwienie oranżem akrydyny ( do bakterii i grzybów)
>Barwienie kalkofluorem
- do wykrywania struktur grzybów i Pneumocystis spp (grzyb)
- barwnik wiąże się z chityną i celulozą
>Barwienie fluorescencyjne z użyciem przeciwciał:
-powstaje kompleks
- do wykrywania Streptococcus, Legionella, Chlamydia,
Cryptosporidium, Giardia, wirus grypy, wirus Herpes Simplex)
> barwienie kalkofluorem
- grzyby, zabarwia chitynę
30
Rodzaje preparatów bakteriologicznych:
Preparaty natywne
| Preparaty barwione
31
Preparaty natywne:
-do obserwacji drobnoustrojów cechujących się RUCHEM WŁASNYM (ŻYWYCH!)
-dwa rodzaje:
>pod szkiełkiem nakrywkowym
>w kropli wiszącej.
-ogląda się pod obiektywem 40x powiększenia BEZ IMERSJI
32
Preparaty barwione:
- obserwację wcześniej utrwalonych (ZABITYCH!) i zabarwionych drobnoustrojów
- informacje o:
```
>morfologii kom. bak.
>ułożeniu
>obecności ziarnistości w cytoplazmie
>obecności otoczek ,przetrwalników
>przynależności do Gram- lub Gram+
```
>ogląda się pod obiektywem 100x powiększenia, przy zastosowaniu OLEJKU IMERSYJNEGO!
33
Do celów mikrobiologicznych stosuje się barwniki rodzaje, co zabarwiają, przykłady
barwniki anilinowe (zasadowe), zabarwiające komórki
- fuksyna zasadowa,
- czerwień obojętna,
- fiolet krystaliczny,
- błękit metylenowy
barwniki kwaśne do wybarwiania podłoża
- nigrozyna
- eozyna
- tusz chiński
34
PODZIAŁ METOD BARWIENIA:
A) Ilość barwników:
Barwienie proste:
- zastosowanie jednego barwnika
- np. barwienie metodą Loefflera i metodą tuszową
-tu występuje metachromazja
Barwienie złożone
- używa się co najmniej dwóch barwników
- np. barwienie metodą Grama, Neissera, Ziehl-Neelsena
B) Co jest zabarwiane?
Barwienie pozytywne – zabarwiają się bakterie, tło nie zabarwione (barwienie metodą Loefflera, Grama)
Barwienie negatywne – zabarwia się tło, bakterie pozostają nie zabarwione (barwienie metodą tuszową)
Barwienie negatywno-pozytywne – zabarwiają się bakterie oraz tło (barwienie metodą Burii-Ginsa, Ziehl-Neelsena)
35
Bejcowanie preparatów:
Bejcowanie preparatów:
- proces zwiększający powinowactwo cytoplazmy komórki bakteryjnej do barwników
- Bejce (płyn Lugola, KOH, kw. chromowy, sole metali ciężkich) umożliwiają tworzenie połączeń chemicznych białek z barwnikiem lub utrwalenie barwnika w preparacie
36
Metachromazja:
Metachromazja
-zjawisko występujące w procesie barwienia prostego. -składniki komórki barwią się odmiennie
-np. po zabarwieniu błękitem Loefflera otoczka laseczki wąglika barwi się na różowo, a kom. na niebiesko
37
Pożywki mikrobiologiczne można podzielić na:
Podłoża nieselektywne
Podłoża selektywne (wybiórcze) i różnicujące
Podłoża specjalne
38
Podłoża nieselektywne:
Przykłady:
- pożywka podstawowa + krew
- do hodowli większości organizmów niemających specjalnych wymagań
- agar z krwią- dla bakterii i grzybów
- agar czekoladowy-dla bakterii, w tym Neisseria gonorrhoeae i Haemophilus
- agar M-H (Muller-Hintona)- używane w oznaczaniu lekowrażliwości bakterii
- bulion tioglikolanowy - bakterii beztlenowych
- agar Sabouraud- dla grzybów
39
agar z krwią:
pożywka podstawowa + krew
| dla bakterii i grzybów
40
agar czekoladowy:
-to modyfikowana pożywka typu agar z krwią
-do ogrzanego podstawowego medium dodana zostanie krew lub hemoglobina, podłoże
to zmienia kolor na brązowy
-dla bakterii Haemophilus i Neisseria gonorrhoeae
41
Agar Mueller-Hintona:
- Składa się z mieszaniny ekstraktu wołowego i kazeiny, soli, kationów dwuwartościowych i rozpuszczalnej skrobi, która jest niezbędna do osiągnięcia powtarzalnych wyników testów
- testowania lekowrażliwości bakterii
42
Bulion z tioglikolanem:
- w do wyhodowania bakterii tlenowych i beztlenowych.
| - wzbogacony bulion dla bakterii beztlenowych
43
Agar Sabouraud:
- kazeina + tk. zwierzęce + glukoza
| - dla grzybów
44
Podłoża selektywne (wybiórcze) i różnicujące:
Przkłady:
- dla hodowli określonych mikroorganizmów będących w mieszaninie innych drobnoustrojów
- z inhibitorami hamującymi wzrost organizmów niepożądanych
agar McConkeya – dla Gram (-), różnicuje bakterie fermentujące laktozę (różowe) od niefermentujących. Sole żółciowe i fiolet krystaliczny hamują wzrost bakterii Gram (+)
- pożywka Chapmana – dla gronkowców, różnicuje gronkowca złocistego (tylko on fermentuje mannitol, który tam jest –żółto zabarwiona otoczka)
- podłoże SS (agar XLD) – różnicuje Salmonella (wytwarza H2S – czarne kolonie) i Shigella
- podłoże Lowensteina-Jensena i Middlebrooka – do izolacji prątków (Mycobacterium)
- CHROMagar – do różnicowania grzybów drożdżopodobnych z rodzaju Candida
C. albicans (zielony),
C. tropicalis (liliowy),
C. krusei (różowe)
45
agar McConkeya
dla Gram (-), różnicuje bakterie fermentujące laktozę (różowe) od niefermentujących
Sole żółciowe i fiolet krystaliczny hamują wzrost bakterii Gram (+)
46
pożywka Chapmana
dla gronkowców
różnicuje gronkowca złocistego, bo tylko on fermentuje mannitol, który tam jest –>żółto zabarwiona otoczka
47
agar XLD (podłoże SS)
różnicuje Salmonella (wytwarza H2S – czarne kolonie) i Shigella
48
podłoże Lowensteina-Jensena i Middelbrooka
do izolacji prątków (Mycobacterium)
49
CHROMagar
do różnicowania grzybów drożdżopodobnych z rodzaju Candida
C. albicans (zielony),
C. tropicalis (liliowy),
C. krusei (różowe)
50
Podłoża specjalne:
Przykłady:
dla szczególnie wymagających drobnoustrojów
podłoże BCYE- dla Legionella i Nocardia
podłoże CLauberga z telurynem potasu- dla
Corynebacterium diphteriae
Bulion LIM- dla Streptoccoccus agalactiae
Agar MacConkeya z sorbitolem- dla E.coli
Agar Regan- Lowe- dla Bordetella pertusis
podłoże TBCS z solami żółci- dla Vibrio cholerae
51
Hodowla komórkowe:
1. drobnoustroje ściśle wewnątrzkomórkowymi rosną tylko w komórkach żywych
2. Hodowle (linie) komórkowe, mogą być:
- albo zaadherowane do powierzchni ->komórki rosną i dzielą się na określonej pow. = linie komórkowe jednowarstwowe
- albo komórki mogą rosnąć jako zawiesina w pożywce
3. Hodowle komórkowe są dobrze ustalone i mogą być prowadzone nieskończenie długo
IINNE hodowle komórkowe muszą być przygotowane
bezpośrednio przed ich zainfekowaniem i nie mogą być podtrzymywane w laboratorium przez
więcej niż kilka podziałów komórkowych (pierwotne linie komórkowe)
4. Ważne aby laboratorium diagnostyczne wybrało odpowiednie podłoża do wyhodowania większości powszechnie występujących patogenów i aby było w stanie wybrać specjalne podłoża, kiedy lekarz podejrzewa obecność określonego drobnoustroju
52
Hodowla komórki
próbki zebrane z naturalnie sterylnych miejsc=> krew, płyn rdzeniowy, tkanki
są posiewane na wzbogacone, nieselektywne agary i buliony
53
Hodowla komórki
to próbka z naturalną, fizjologiczną florą pacjenta:
podłoże selektywne (wybiórcze) i różnicujące
