Bakterie- morfologia i metody barwienia Flashcards
Wielkość (wymiary) bakterii- ogólnie:
UWAGA!!!
Nowo odkryte gatunki na przykład (x1) ……………………. są kilkaset razy większe od bakterii przeciętnej wielkości i mogą być widziane już gołym okiem
Większość od 1 do kilku mikrometrów
np. Thiomargarita namibiensis
1 mikrometr ile to metrów
10 do potęgi -6 metra
Najmniejsze bakterie- podaj rodzaj bakterii i wielkość
Mycoplasma i riketsje -> 0,15 do 0,2 mikrometra
Największe bakterie- podaj rodzaj bakterii i wielkość
Spirillum -> ponad 40 mikrometrów
Typy morfologiczne bakterii- ze względu na kształt:
Wyróżniamy 4 typy bakterii:
- kuliste (owalne)
- cylindryczne
- spiralne
- nitkowate
Bakterie kuliste (owalne) to: x5
dwoinki ( Neisseria ) tetrady ( Micrococcus ) czworaczki i sześcianki ( Sarcina ) gronkowce ( Staphylococcus ) paciorkowce ( Streptococcus )
Bakterie cylindryczne to: x5
pałeczki (np. Escherichia coli) laseczki ( Bacillus, Clostridium ) maczugowce ( Corynobacterium ) prątki ( Mycobacterium ) wrzecionowce ( Fusobacterium )
Bakterie spiralne to: x3
śrubowce ( Spirillum )
przecinkowce ( Vibrio )
krętki ( Leptospira, Borrelia, Treponema )
Bakterie nitkowate to: x2
Actinomyces
Nocardia
Różnice między Eukaryota a Prokaryota
-Komórki zwierząt, roślin i grzybów określane są mianem eukariontów
-bakterie i niebieskozielone glony
(sinice) należą do prokariontów
- Komórki prokariotyczne różnią się od eukariotycznych: -brakiem jądra i niektórych organelli
-chromosomami
-> chromosom typowej bakterii (takiej jak Escherichia coli) jest:
pojedynczą
dwuniciową
kolistą cząsteczką (DNA)- zawierającą ok 5 milionów par zasad o długości 1,3 mm
najmniejsze chromosomy bakteryjne (np. mykoplazm) są 4 razy krótsze
**Dla porównania – ludzie posiadają:
dwie kopie 23 chromosomów, których
długość wynosi 990 mm, a liczba par zasad to aż 2,9 × 10 do potęgi 9
Rybosomy bakteryjne są mniejsze/ większe od rybosomów komórek eukariotycznych
mniejsze
u większości bakterii występuje podobna w swej strukturze do gęstego sita, peptydoglikanowa:
ściana komórkowa otaczająca błony i chroniąca je przed czynnikami środowiskowymi
Bakterie potrafią / nie potrafią przeżyć w nieprzyjemnych warunkach środowiska
potrafią przeżyć a w niektórych przypadkach nawet
wzrastać w nieprzyjaznym środowisku
(np. zew. ciś.osmotycznym tak niskim, że doprowadziłoby ono do lizy większość komórek eukariotycznych)
Bakterie potrafią przetrwać także w ekstremalnie wysokich i niskich temperaturach, w warunkach suszy i w obecności bardzo nikłych źródeł energii
Dlaczego bakterie potrafią przetrwać w ekstremalnie wysokich i niskich temperaturach i w warunkach suszy i w obecności bardzo nikłych źródeł energii??
Bo wykształcają struktury i mechanizmy pozwalające im na adaptację do takich warunków
Bakterie wstępnie identyfikuje się przez analizę ich wzrostu na charakterystycznych podłożach selekcyjnych
kolor rozmiar kształt zapach zdolność do rozkładu cukrów( np. laktozy -rozróżnienie między E. coli a Salmonella ) zdolność do lizy erytrocytów- hemoliza zdolność do hydrolizy tłuszczów (np. lipaza Clostridium). oporność na określone antybiotyki
Mikroskopu używa się w mikrobiologii do
dwóch głównych celów:
1) wstępnego wykrycia drobnoustrojów
2) wstępnej lub ostatecznej identyfikacji drobnoustrojów
Badanie mikroskopowe próbek materiału klinicznego jest stosowane do wykrywania:
komórek bakteryjnych
form morfologicznych grzybów, pasożytów (jaja, larwy, postaci dorosłe)
wtrętów wirusowych obecnych w zainfekowanym
materiale
Metody mikroskopowe: x5
a) Mikroskopia jasnego pola (świetlna)
b) Mikroskopia ciemnego pola
c) Mikroskopia kontrastowo-fazowa
d) Mikroskopia fluorescencyjna
e) Mikroskopia elektronowa
Mikroskopia jasnego pola (świetlna)
- źródło światła
2.kondensor skupia światło na preparacie
3.system dwóch soczewek (soczewka obiektywu
i soczewka okularu) - powiększenie obrazu jest pochodną
powiększenia soczewki obiektywu i okularu
5.trzech różnych soczewki obiektywu:
>małej mocy (powiększenie x10) do przeglądania próbki
>dużej mocy (powiększenie x40) do poszukiwania dużych drobnoustrojów jak pasożyty i grzyby strzępkowe
>bardzo dużej mocy z użyciem immersji olejowej (100xpowiększenie) do obserwowania bakterii,
drożdży i szczegółów morfologicznych większych organizmów i komórek - Ograniczeniem jest rozdzielczość obrazu (zdolność do rozróżnienia, że dwa obiekty są odrębne i nie są jednym)
- Zdolność rozdzielcza większa, gdy olejek
immersyjny umieszczony między soczewką obiektyw a preparatem, bo olejek redukuje dyspersję światła - Najlepsze mają zdolność rozdzielczą o wartości w przybliżeniu 0,2 µm - zobaczenie większości bakterii, ale NIE WIRUSÓW
Mikroskopia ciemnego pola:
- system dwóch soczewek (soczewka obiektywu
i soczewka okularu)
2.używa się specjalnego kondensora (lub kondensora pokrytego olejkiem immersyjnym)- zapobiega
bezpośredniemu oświetlaniu preparatu
3.preparat jest podświetlony na jasno w ciemnym tle - lepsza zdolność rozdzielcza (0,02 µm w porównaniu z 0,2 µm)
- struktury wewnętrzne drobnoustrojów nie
mogą być obserwowane, bo światło przechodzi wokół niż przez drobnoustroje
- struktury wewnętrzne drobnoustrojów nie
Mikroskopia kontrastowo-fazowa:
- badanie szczegółów budowy wew. drobnoustrojów + obraz 3D
- równoległe wiązki światła przechodzą przez obiekty o różnej gęstości wiązka przechodząca przez bardziej gęsty materiał jest opóźniona bardziej niż druga wiązka
3.pierścieniowehobwódki w kondensorze i soczewce obiektywu - światło w obserwowanym obiekcie wydaje
się jaśniejsze niż poza nim
Mikroskopia fluorescencyjna:
- niektóre drobnoustroje wykazują naturalną fluorescencję (autofluorescencja)
- związki zwane fluorochromami mogą absorbować
światło ultrafioletowe lub ultraniebieskie o krótkiej długości fali i emitować energię w postaci światła widzialnego o większej długości fali - używa się wysokociśnieniowych lamp rtęciowych, halogenowych lub ksenonowych, które emitują światło o krótszej fali
- preparaty wybarwione: podświetlone na jasno na ciemnym tle => duży kontrast
Mikroskopia elektronowa:
- w mikroskopach elektronowych używane są cewki magnetyczne (zamiast soczewek)
- cewki magnetyczne kierują wiązkę elektronów z włókna wolframowego przez preparat na ekran
- znacznie krótsza fala światła= powiększenie i rozdzielczość są znacznie lepsze
- preparaty barwione lub pokryte jonami metali
w celu stworzenia kontrastu - dwa rodzaje mikroskopów elektronowych: ->ELEKTRONOWY MIKROSOP TRANSMISYJNY
elektrony tak jak światło przechodzą bezpośrednio przez preparat
>MIKROSKOP ELEKTRONOWY SKANINGOWY
elektrony odbijają się od pow. preparatu
pod kątem i powstaje obraz trójwymiarowy powierzchni
obiektu
Metody badawcze / barwienia:
- badanie bezpośrednie
- różnicujące
- barwienie w kierunku bakterii kwasoopornych
- fluoroscencyjne
badanie bezpośrednie cechy:
odmiana badania bezpośredniego to + cechy:
- proste do przygotowania
2.> próbka= preparat natywny (przyżyciowy) + KOH
albo
>próbka= preparat natywny (przyżyciowy) + KOH + barwnik kontrastujący ( laktofenol, jod ) - barwnik wzmacnia kontrast w stosunku do tła
- szczegółowe badanie struktur
KOH używany jest w celu rozpuszczenia materiału białkowego i ułatwienia detekcji elementów grzybów, które nie są niszczone przez silne roztwory zasadowe. Aby zwiększyć kontrast między elementami grzybów a tłem można dodać barwniki, takie jak laktofenol
odmiana to metoda z tuszem chińskim (India ink)
- tusz zaciemnia tło
- pozostawiając komórkę niezabarwioną
- do wykrywania otoczek organizmów grzybów drożdżopodobnych Cryptococcus
- Barwnik używany głównie do wykrywania Cryptococcus spp. w płynie mózgowo-rdzeniowym i innych płynach ciała
Barwienie różnicujące:
- barwienia określonych składników materiału komórkowego
- różne metody:
> Barwienie metodą Gram: bakterie gram+ i gram- oraz grzyby drożdżopodobne (są Gram+)
> Hematoksylina żelazowa:
pierwotniaków pasożytnicze w kale
> barwienie trójkolorowe: alternatywa dla barwienia hematoksyliną żelazową
>barwienie metodą Wrighta-Giemsy -do wykrywania pierwotniaków krwi -ciałek wtrętowych wirusów -mikroorganizmów z rodzaju: Chlamydia, Borellia, Toksoplazma, Pneumocystis i Rickettsia
> srebrem do wykrywania elementów grzybów i bakterii w tkance
> błękitem toluidyny O do wykrywania Pneumocystis w próbkach z układu oddechowego
Barwienie metodą Grama:
podstawę do wydzielenia
głównych grup bakterii bakterie gram+ i gram- oraz grzyby drożdżopodobne (są Gram+)
1.Po utrwaleniu próbki na szkiełku
mikroskopowym (przez podgrzewanie lub stosowanie alkoholu), nanoszony jest fiolet krystaliczny
2. dodawana jest jodyna (płyn Lugola) w celu wytworzenia kompleksu z podstawowym barwnikiem. 3. Kolejno podczas odbarwiania alkoholem lub acetonem kompleks jest zatrzymywany w bakteriach Gram+, ale eliminowany w Gram-
4. Następnie kontrastowe barwienie safraniną lub fuksyną uwidacznia się w organizmach Gram-ujemnych
(czerwony kolor)
Stopień, w jakim mikroorganizm pozostanie wybarwiony zależy
od typu drobnoustroju, warunków posiewu i umiejętności osoby wykonującej barwienie.
- Barwienie w kierunku bakterii kwasoopornych:
- zachowują barwnik w komórce, nawet po zastosowaniu silnych czynników odbarwiających
- trzy różne metody barwienia:
> Metoda Ziehl-Neelsena:
- wymaga podgrzewania próbki
- do barwienia mykobakterii
- organizmy te są czerwone na jasnoniebieskim tle
> metoda Kinyouna:
- jak metoda Ziehl-Neelsena
- ale nie wymaga podgrzewania !!!
> metoda auramina-rodamina
-barwniki fluorescencyjne
> Zmodyfikowane
barwienie w kierunku
kwasooporności:
- słaby czynnik odbarwiając
- odbarwiają się np. Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Gordonia, Cryptosporidium, Isospora, Sarcocystis i Cyclospora
Barwienie fluoroscencyjne:
- Rodzaje:
> Barwienie auraminą-rodaminą
> Barwienie oranżem akrydyny ( do bakterii i grzybów)
> Barwienie kalkofluorem
- do wykrywania struktur grzybów i Pneumocystis spp (grzyb)
- barwnik wiąże się z chityną i celulozą
> Barwienie fluorescencyjne z użyciem przeciwciał:
-powstaje kompleks
- do wykrywania Streptococcus, Legionella, Chlamydia,
Cryptosporidium, Giardia, wirus grypy, wirus Herpes Simplex)
> barwienie kalkofluorem
- grzyby, zabarwia chitynę
Rodzaje preparatów bakteriologicznych:
Preparaty natywne
Preparaty barwione
Preparaty natywne:
-do obserwacji drobnoustrojów cechujących się RUCHEM WŁASNYM (ŻYWYCH!)
-dwa rodzaje:
>pod szkiełkiem nakrywkowym
>w kropli wiszącej.
-ogląda się pod obiektywem 40x powiększenia BEZ IMERSJI
Preparaty barwione:
- obserwację wcześniej utrwalonych (ZABITYCH!) i zabarwionych drobnoustrojów
- informacje o:
>morfologii kom. bak. >ułożeniu >obecności ziarnistości w cytoplazmie >obecności otoczek ,przetrwalników >przynależności do Gram- lub Gram+
> ogląda się pod obiektywem 100x powiększenia, przy zastosowaniu OLEJKU IMERSYJNEGO!
Do celów mikrobiologicznych stosuje się barwniki rodzaje, co zabarwiają, przykłady
barwniki anilinowe (zasadowe), zabarwiające komórki
- fuksyna zasadowa,
- czerwień obojętna,
- fiolet krystaliczny,
- błękit metylenowy
barwniki kwaśne do wybarwiania podłoża
- nigrozyna
- eozyna
- tusz chiński
PODZIAŁ METOD BARWIENIA:
A) Ilość barwników:
Barwienie proste:
- zastosowanie jednego barwnika
- np. barwienie metodą Loefflera i metodą tuszową
-tu występuje metachromazja
Barwienie złożone
- używa się co najmniej dwóch barwników
- np. barwienie metodą Grama, Neissera, Ziehl-Neelsena
B) Co jest zabarwiane?
Barwienie pozytywne – zabarwiają się bakterie, tło nie zabarwione (barwienie metodą Loefflera, Grama)
Barwienie negatywne – zabarwia się tło, bakterie pozostają nie zabarwione (barwienie metodą tuszową)
Barwienie negatywno-pozytywne – zabarwiają się bakterie oraz tło (barwienie metodą Burii-Ginsa, Ziehl-Neelsena)
Bejcowanie preparatów:
Bejcowanie preparatów:
- proces zwiększający powinowactwo cytoplazmy komórki bakteryjnej do barwników
- Bejce (płyn Lugola, KOH, kw. chromowy, sole metali ciężkich) umożliwiają tworzenie połączeń chemicznych białek z barwnikiem lub utrwalenie barwnika w preparacie
Metachromazja:
Metachromazja
-zjawisko występujące w procesie barwienia prostego. -składniki komórki barwią się odmiennie
-np. po zabarwieniu błękitem Loefflera otoczka laseczki wąglika barwi się na różowo, a kom. na niebiesko
Pożywki mikrobiologiczne można podzielić na:
Podłoża nieselektywne
Podłoża selektywne (wybiórcze) i różnicujące
Podłoża specjalne
Podłoża nieselektywne:
Przykłady:
- pożywka podstawowa + krew
- do hodowli większości organizmów niemających specjalnych wymagań
- agar z krwią- dla bakterii i grzybów
- agar czekoladowy-dla bakterii, w tym Neisseria gonorrhoeae i Haemophilus
- agar M-H (Muller-Hintona)- używane w oznaczaniu lekowrażliwości bakterii
- bulion tioglikolanowy - bakterii beztlenowych
- agar Sabouraud- dla grzybów
agar z krwią:
pożywka podstawowa + krew
dla bakterii i grzybów
agar czekoladowy:
-to modyfikowana pożywka typu agar z krwią
-do ogrzanego podstawowego medium dodana zostanie krew lub hemoglobina, podłoże
to zmienia kolor na brązowy
-dla bakterii Haemophilus i Neisseria gonorrhoeae
Agar Mueller-Hintona:
- Składa się z mieszaniny ekstraktu wołowego i kazeiny, soli, kationów dwuwartościowych i rozpuszczalnej skrobi, która jest niezbędna do osiągnięcia powtarzalnych wyników testów
- testowania lekowrażliwości bakterii
Bulion z tioglikolanem:
- w do wyhodowania bakterii tlenowych i beztlenowych.
- wzbogacony bulion dla bakterii beztlenowych
Agar Sabouraud:
- kazeina + tk. zwierzęce + glukoza
- dla grzybów
Podłoża selektywne (wybiórcze) i różnicujące:
Przkłady:
- dla hodowli określonych mikroorganizmów będących w mieszaninie innych drobnoustrojów
- z inhibitorami hamującymi wzrost organizmów niepożądanych
agar McConkeya – dla Gram (-), różnicuje bakterie fermentujące laktozę (różowe) od niefermentujących. Sole żółciowe i fiolet krystaliczny hamują wzrost bakterii Gram (+)
- pożywka Chapmana – dla gronkowców, różnicuje gronkowca złocistego (tylko on fermentuje mannitol, który tam jest –żółto zabarwiona otoczka)
- podłoże SS (agar XLD) – różnicuje Salmonella (wytwarza H2S – czarne kolonie) i Shigella
- podłoże Lowensteina-Jensena i Middlebrooka – do izolacji prątków (Mycobacterium)
- CHROMagar – do różnicowania grzybów drożdżopodobnych z rodzaju Candida
C. albicans (zielony),
C. tropicalis (liliowy),
C. krusei (różowe)
agar McConkeya
dla Gram (-), różnicuje bakterie fermentujące laktozę (różowe) od niefermentujących
Sole żółciowe i fiolet krystaliczny hamują wzrost bakterii Gram (+)
pożywka Chapmana
dla gronkowców
różnicuje gronkowca złocistego, bo tylko on fermentuje mannitol, który tam jest –>żółto zabarwiona otoczka
agar XLD (podłoże SS)
różnicuje Salmonella (wytwarza H2S – czarne kolonie) i Shigella
podłoże Lowensteina-Jensena i Middelbrooka
do izolacji prątków (Mycobacterium)
CHROMagar
do różnicowania grzybów drożdżopodobnych z rodzaju Candida
C. albicans (zielony),
C. tropicalis (liliowy),
C. krusei (różowe)
Podłoża specjalne:
Przykłady:
dla szczególnie wymagających drobnoustrojów
podłoże BCYE- dla Legionella i Nocardia
podłoże CLauberga z telurynem potasu- dla
Corynebacterium diphteriae
Bulion LIM- dla Streptoccoccus agalactiae
Agar MacConkeya z sorbitolem- dla E.coli
Agar Regan- Lowe- dla Bordetella pertusis
podłoże TBCS z solami żółci- dla Vibrio cholerae
Hodowla komórkowe:
- drobnoustroje ściśle wewnątrzkomórkowymi rosną tylko w komórkach żywych
- Hodowle (linie) komórkowe, mogą być:
- albo zaadherowane do powierzchni ->komórki rosną i dzielą się na określonej pow. = linie komórkowe jednowarstwowe
- albo komórki mogą rosnąć jako zawiesina w pożywce - Hodowle komórkowe są dobrze ustalone i mogą być prowadzone nieskończenie długo
IINNE hodowle komórkowe muszą być przygotowane
bezpośrednio przed ich zainfekowaniem i nie mogą być podtrzymywane w laboratorium przez
więcej niż kilka podziałów komórkowych (pierwotne linie komórkowe) - Ważne aby laboratorium diagnostyczne wybrało odpowiednie podłoża do wyhodowania większości powszechnie występujących patogenów i aby było w stanie wybrać specjalne podłoża, kiedy lekarz podejrzewa obecność określonego drobnoustroju
Hodowla komórki
próbki zebrane z naturalnie sterylnych miejsc=> krew, płyn rdzeniowy, tkanki
są posiewane na wzbogacone, nieselektywne agary i buliony
Hodowla komórki
to próbka z naturalną, fizjologiczną florą pacjenta:
podłoże selektywne (wybiórcze) i różnicujące
