B Flashcards
Décris les étapes de la transcription de l’ADN en ARN chez les procaryotes, en mettant l’accent sur les phases d’initiation, d’élongation et de terminaison.
La transcription chez les procaryotes commence par la formation du complexe d’initiation. L’ARN polymérase (holoenzyme) se lie au promoteur grâce à la sous-unité sigma qui reconnaît les séquences -10 (boîte de Pribnow) et -35. Une fois la liaison formée, l’ARN polymérase provoque l’ouverture locale de l’ADN pour créer un complexe ouvert et initier la synthèse. L’initiation produit souvent de courts fragments d’ARN (synthèse abortive) avant que l’ARN polymérase ne se stabilise. Durant l’élongation, l’ARN polymérase progresse le long de l’ADN, ajoutant des nucléotides complémentaires au brin matrice. Une fois le site de terminaison atteint, deux mécanismes peuvent arrêter la transcription : la terminaison indépendante de Rho, qui repose sur la formation d’une tige-boucle suivie d’une série d’Uracile, et la terminaison dépendante de Rho, qui nécessite la protéine Rho pour séparer l’ARN de l’ADN.
Compare les ARN polymérases I, II, et III chez les eucaryotes en termes de structure, de localisation et de types d’ARN qu’elles synthétisent.
Les eucaryotes possèdent trois ARN polymérases principales, chacune ayant un rôle spécifique. L’ARN polymérase I se trouve dans le nucléole et synthétise les grands précurseurs d’ARN ribosomiques, essentiels pour la formation des ribosomes. L’ARN polymérase II est située dans le nucléoplasme et est responsable de la transcription des ARN messagers (ARNm), des miARNs et d’autres petits ARN régulateurs. Sa complexité permet une régulation fine de l’expression génique. Enfin, l’ARN polymérase III, également dans le nucléoplasme, transcrit des petits ARN comme les ARN de transfert (tRNA) et l’ARN 5S.
Chacune de ces ARN polymérases possède des sous-unités uniques et des facteurs de transcription spécifiques, permettant d’assurer une spécificité de reconnaissance des promoteurs selon le type d’ARN à transcrire.
Explique le mécanisme de translocation de l’ARN polymérase II durant la phase d’élongation de la transcription chez les eucaryotes. Quel est le rôle de l’hélice pont (bridge helix) dans ce processus ?
Durant l’élongation, l’ARN polymérase II progresse le long de l’ADN matrice en ajoutant des nucléotides à l’extrémité 3’ de l’ARN en cours de synthèse. L’hélice pont (bridge helix) est une structure flexible qui facilite le mouvement de translocation de l’ARN polymérase d’un nucléotide à la fois. Après l’ajout d’un nouveau NTP au site actif, l’hélice pont se déplace pour pousser l’ARN polymérase en avant. Ce mouvement est couplé à la réorganisation du site actif, ce qui positionne correctement le prochain NTP à incorporer. Cela permet de garantir la précision et la continuité de la synthèse de l’ARN. La translocation est un processus dynamique qui assure l’avancée fluide de la polymérase tout en maintenant l’intégrité de la bulle transcriptionnelle.
Décris la technique de footprinting à l’ADNase I et son utilité pour identifier les sites de liaison des protéines sur l’ADN.
Le footprinting à l’ADNase I est une méthode permettant de déterminer les sites de liaison d’une protéine sur l’ADN. Le fragment d’ADN à analyser est marqué à une extrémité, puis divisé en deux échantillons : l’un avec la protéine liée et l’autre sans. Les deux échantillons sont traités par l’ADNase I, qui coupe aléatoirement l’ADN. Dans l’échantillon sans protéine, l’ADNase I produit une échelle complète de fragments de différentes tailles. Dans l’échantillon avec protéine, les régions où la protéine est fixée sont protégées contre la digestion, formant des zones de protection visibles sous forme de bandes manquantes sur le gel d’électrophorèse. Cela permet d’identifier les régions précises où la protéine est fixée sur l’ADN.
Décris le mécanisme de terminaison de la transcription chez les eucaryotes, en expliquant le rôle du clivage et de la polyadénylation.
Chez les eucaryotes, la terminaison de la transcription par l’ARN polymérase II est déclenchée par la présence d’une séquence de polyadénylation (AAUAAA) sur l’ARNm. Une fois cette séquence transcrite, un complexe protéique incluant CPSF (Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor) se lie au signal de polyadénylation et recrute d’autres protéines pour effectuer le clivage de l’ARN en aval de cette séquence. Ensuite, l’enzyme PAP (Poly(A) Polymerase) ajoute une queue poly(A) à l’extrémité 3’ de l’ARN, composée de plusieurs résidus adényliques (AAAA…). Cette queue poly(A) protège l’ARNm contre la dégradation et facilite son exportation vers le cytoplasme. La dégradation de l’ARN restant attaché à l’ARN polymérase II entraîne la dissociation de l’enzyme de l’ADN, mettant ainsi fin à la transcription.
Compare les techniques de footprinting à l’ADNase I et au Diméthyl Sulfate (DMS). Quelles sont les similitudes et les différences entre ces deux méthodes ?
Les techniques de footprinting à l’ADNase I et au DMS partagent un objectif commun : déterminer les sites de liaison d’une protéine sur un fragment d’ADN. Cependant, elles utilisent des réactifs différents et fournissent des informations complémentaires. Le footprinting à l’ADNase I repose sur une digestion enzymatique : l’ADNase I coupe l’ADN de façon aléatoire en présence et en absence de la protéine. Les zones protégées par la protéine apparaissent comme des bandes manquantes sur le gel d’électrophorèse. En revanche, le footprinting au DMS utilise un agent chimique qui méthyle spécifiquement les groupements N7 des guanines. En présence de la protéine, certaines bases sont protégées ou sensibilisées par la fixation de la protéine, modifiant leur accessibilité au DMS. Ainsi, le footprinting à l’ADNase I identifie les régions protégées par la protéine, tandis que le footprinting au DMS permet également de détecter les changements conformationnels de l’ADN induits par la protéine. En résumé, l’ADNase I révèle les sites de contact protéine-ADN, tandis que le DMS peut montrer à la fois les sites protégés et les effets structuraux de la liaison.
Explique comment la technique de footprinting à l’ADNase I permet de déterminer les zones protégées sur un fragment d’ADN. Quelles précautions expérimentales doivent être prises pour obtenir des résultats interprétables ?
Le footprinting à l’ADNase I est une méthode qui repose sur le principe que les protéines liées à l’ADN protègent certaines régions de l’ADN contre la digestion enzymatique. Tout d’abord, un fragment d’ADN marqué est divisé en deux échantillons : un avec la protéine liée et l’autre sans. Les deux échantillons sont ensuite traités par une concentration diluée d’ADNase I, de sorte qu’elle n’effectue qu’une coupure par molécule d’ADN. Cette dilution est cruciale car une concentration trop élevée entraînerait trop de coupures, rendant l’identification des zones protégées difficile. Les fragments d’ADN sont séparés par électrophorèse et visualisés par autoradiographie. Les bandes manquantes sur le gel correspondent aux sites protégés par la protéine, alors que les bandes présentes montrent les sites coupés. Pour obtenir des résultats interprétables, il est essentiel de calibrer la concentration d’ADNase I et de s’assurer que les bandes sont distinctes et non superposées, afin de localiser précisément les régions de protection.
Décris le principe de l’empreinte au Diméthyl Sulfate (DMS) et comment cette technique permet d’identifier les effets conformationnels d’une protéine sur l’ADN. Pourquoi le DMS est-il utilisé spécifiquement pour cette technique ?
Le footprinting au Diméthyl Sulfate (DMS) est une technique qui permet de cartographier à la fois les sites de liaison d’une protéine et les modifications conformationnelles de l’ADN. Le DMS est un réactif chimique qui méthyle de façon spécifique les groupements N7 des guanines et les N3 des adénines. Ces modifications rendent les bases méthylées plus susceptibles de dénaturation, ce qui entraîne la formation de sites apuriniques. L’ADN est ensuite traité pour casser ces sites, générant des fragments d’ADN de tailles variées. En présence de la protéine liée, certaines bases seront protégées du DMS, tandis que d’autres peuvent devenir plus sensibles en raison de changements conformationnels. Ainsi, sur le gel, on peut voir des bandes manquantes (protection) ou bandes plus intenses (sensibilisation). Le DMS est idéal pour cette technique car il est suffisamment petit pour pénétrer facilement l’ADN, et ses modifications chimiques sont facilement détectables, ce qui permet d’analyser des changements subtils dans la structure de l’ADN.
Interprétez lds résultats obtenus dans la méthode de footprinting à partir d’un gel. Que signifient des bandes manquantes et des bandes présentes plus intenses dans les échantillons avec vs sans protéine ?
Le gel montre les résultats d’une expérience de footprinting avec plusieurs échantillons : un contrôle sans protéine, un échantillon avec l’ARN polymérase, et un échantillon avec un répresseur.
Dans l’échantillon sans protéine, toutes les positions de l’ADN sont coupées aléatoirement par l’ADNase I, ce qui génère une échelle complète de fragments de tailles variées.
Dans l’échantillon avec ARN polymérase, certaines bandes manquent dans la zone correspondant à la région du promoteur, indiquant que l’ARN polymérase protège cette région contre la digestion.
Pour l’échantillon avec le répresseur, une empreinte différente est observée, correspondant au site de liaison du répresseur sur l’ADN.
Les bandes manquantes correspondent aux sites protégés, et les bandes présentes montrent les coupures dans les régions non protégées. Une zone avec plusieurs bandes absentes indique un site de liaison large ou une protection totale, tandis qu’une intensité plus faible des bandes pourrait indiquer une protection partielle.
Pourquoi la concentration de l’ADNase I est-elle critique dans la technique de footprinting ? Que se passerait-il si la concentration était trop élevée ou trop faible ?
La concentration de l’ADNase I est cruciale car elle détermine le nombre de coupures effectuées sur chaque molécule d’ADN. Si la concentration est trop élevée, l’ADNase I coupera l’ADN à plusieurs positions par molécule, ce qui rendrait difficile l’identification des zones protégées. En effet, trop de coupures entraîneraient un chevauchement des bandes sur le gel, rendant l’analyse impossible. À l’inverse, si la concentration est trop faible, il pourrait n’y avoir aucune coupure dans certaines molécules, ce qui entraînerait une absence de signal sur le gel. La concentration optimale permet d’obtenir une coupure par molécule en moyenne, ce qui est idéal pour visualiser les bandes de protection et comparer les échantillons. Cette précision est nécessaire pour interpréter correctement les sites de liaison de la protéine et leur impact sur la structure de l’ADN.
