ARN d'interférence Flashcards
Que sont les ARN d’interférence?
Petits ARN non-codants.
Quels sont les 3 types d’ARNi?
- Voie RdDM (méthylation de l’ADN dépendante de l’ARN)
- Voie antivirale : siARNs
- Voie des miARNs
Vrai ou faux : la voie antivirale (siARNs) et des miARNs sont toutes les 2 de l’extinction génique transcriptionnelle.
Faux : post-transcriptionnelle. La voie de la méthylation est de l’extinction génique transcriptionnelle.
Que fait l’extinction génique post-transcriptionnelle des voies impliquées de l’ARNi?
Inhibe la traduction de l’ARN ou le clive
Que fait l’extinction génique transcriptionnelle des voies impliquées de l’ARNi?
Induction de méthylations sur l’ADN de la plante, ce qui compacte la chromatine et inhibe la transcription.
Comment appelle-t-on la polymérase qui se charge de former de l’ARN double brin?
RdRp : ARN polymérase ARN dépendante
Quelles sont les étapes globales qu’effectuent les ARNi pour induire l’immunité de la plante?
- Fabrication de l’ARN double brin par l’ARN polymérase ARN dépendante
- ARN double brin active la machinerie Dicer qui reconnait l’ARN double brin et va le transformer en ARNi
- Complexe RISC avec la protéine Argonaute se lie aux ARNi et garde un des 2 brins
- Homologie de séquence entre l’ARNi et un brin d’ARN : activité hélicase qui dégrade l’ARN
Quelle est la taille des fragments d’ARNi?
21-23 nucléotides
Quelle enzyme va couper des fragments d’ARNdb pour former les ARNi?
Le Dicer
Quelle est l’enzyme très importante dans le complexe RISC?
Argonaute
À quoi sert le complexe RISC dans l’activité ARNi?
Prélève un ARNi (ARNsb de 21-23 nucléotides) pour trouver une séquence complémentaire
Vrai ou faux : l’activité ARNi se fait exclusivement sur de l’ARN double brin
Faux : une fois l’ARNi formé, détection possible sur les ARNsb.
Combien est-ce qu’il y a de polymérase RdRP chez arabidopsis?
6
Combien est-ce qu’il y a de Dicers chez arabidopsis?
4
Combien est-ce qu’il y a de protéines argonaute chez arabidopsis?
10
Pourquoi est-ce que l’immunité par les ARNi peut aussi fonctionner chez les virus à ADN?
Il y a quand même formation d’un ARN double brin à un moment ou à un autre.
Décrivez le mécanisme de méthylation de l’ADN dépendante de l’ARN voie RdDM
RDR2 synthétise un deuxième brin d’ARN sur un ARN préexistant.
DCL3 scinde l’ARNdb en morceaux de 24 nt (siRNA)
AGO4 du complexe RISC prend un des brins du siRNA et l’amène dans le noyau
Le complexe RISC se pose au bon endroit sur le génome grâce au siRNA
Méthylation de l’ADN via l’enzyme DRM2 = compaction de la chromatine
Décrire la voie de miARN
Expression du gène du miARN
Formation d’une tige-boucle (complémentarité sur un même brin)
DCL1 clive une petite portion de la tige boucle aux extrémité pour former un miARN précurseur.
DCL1 enlève la boucle (régions non-appariées de la tige boucle) pour former un miARN mature.
Le complexe RISC prend un des brins du miARN via AGO1
Appariement du miARN à un ARNm.
Si il y y une homologie important = clivage entre le de l’ARNm au niveau du 10-11e nt du miARN
Si pas important = inhibition de la traduction
Quelles enzymes sont responsable de dégrader les petits ARNs non-codant particulièrement le miARN
SDN (small degrading nuclease)
Comment faire de l’ARN d’interférence db pour une étude?
- Façon transgénique
Sens-antisens
Avec agrobacterium tumefaciens, on place un gène dans la plant qui contient 2 fois le gène de la GFP. 1 sens, 1 antisens
Quand ils seront transcrit les deux gènes de la GFP vont s’apparier.
Si la GFP disparait, ça veut dire qu’il y a des ARNi qui capte les ARN double brin.
Comment faire de l’ARN d’interférence db pour une étude?
- Façon transgénique
Cosupression
Avec agrobacterium, on donne le gène CHS (chalcone synthase) déjà présent dans la plante.
Il y 2 gènes CHS.
Les transcrits de chaque gène s’associent ensemble dans certaines lignées transgénique et forme de l’ARN double brin.
Comment les ARNdb synthétisés se déplacent de cellule en cellules?
Plasmodesme et vaisseaux conducteur
Mis en évident par la méthode sens-antisens
Décrivez le mécanisme de la technologie VIGS (virus induced Gene Silencing)
Agrobacterium tumefaciens
ex. phytoène désaturase
Clonage du gène d’un virus dans Agrobacterium (réplicase, PM, protéine de la capside) dans lequel on a ajouté des sites de clonage multiple qui permettent d’insérer une partie (300 pb) du gène de la phytoène désaturase qui agit dans la synthèse de chlorophylle
L’ADNt d’agrobacterium devient db dans la cellule à cause de la réplicase.
DCL dégrade l’ARNdb pour faire des ARNi. Certains de ces ARNi correspondent à la portion du gène de la phytoène désaturase.
Complexe RISC/AGO prend les ARNi
Les ARNi contenant une région de la phytoène auront 100% d’homologie avec l’ARNm de la phytoène qui sera clivé.
Quels sont les désavantages de la technologie VIGS? (3)
L’inhibition du gène ne se fait pas à 100% (knock-down)
Masque certains phénotypes (réaction lié à la présence du génome du virus et non à cause du gène d’intérêt)
Silencer d’autres gènes non ciblés
Quels sont les avantages de la technologie VIGS? (4)
Très rapides (3 semaines) comparativement à minimum 1 an pour une plante transgénique complète.
Moins couteux
Silencer plusieurs gènes
Pas de transformation génétique
Qu’est-ce qu’un knock-down?
Comme un Knock-out mais il y a encore un peu de transcription. Inhibition incomplète.
Quels contrôles (2) devrait-on utiliser pour la technologie VIGS (génétique inverse)?
Un plasmide Ti avec l’ADN virale mais pas la séquence de l’ARN cible dans le site de clonage multiple.
Amplification qPCR d’un gène housekeeping (qui ne varie pas)
Est-il possible de cribler une banque d’ADNc avec la technonolgie VIGS? Comment.
Oui, c’est de la génétique inverse.
On intègre la banque d’ADNc dans le plasmide Ti (1 ADNc/plasmide)
on infecte plusieurs plante (1 plante/plasmide)
on observe les phénotypes intéressant
on amplifie le plasmide qui donnait un phénotype intéressant par PCR
On trouve le gènes correspondant en alignant les séquences
Est-ce que toutes les plantes réagissent aussi bien à la technologie VIGS?
Non, car elle ne réagissent pas toutes de la même manière au virus dans le plasmide Ti. Il faut parfois changer de virus dans le plasmide Ti.
Que sont les SAR?
Suppresseur de l’ARNi. Co-évolution. Produit par les virus
Si on ajoute le gène HcPro (helper component protease) à un virus que se passe-t-il?
Une plante normalement résistante devient sensible.
Comment mettre en évidence la suppression d’ARNi?
On prend une plante GFP (verte lorsque stimulé au UV)
On fait la technologie VIGS avec le PVX (Potato virus X) et la GFP.
La GFP est silencé et la plante devient rouge au UV (chlorophylle sous UV = rouge)
On infecte encore la plante avec PVX mais là avec la séquence de P19
Inhibition des ARNi par P19
Retour de la GFP
Comment P19 inhibe-t-il les ARNi?
P19 se dimérise et séquestre les petits ADN produit par dicer. RISC ne peut pas prendre les petits ARN
Quel mutant de la P19 inhibe la dimérisation de la P19 et donc son activité de silencing?
R72.
Position 72
Comment peut-on faire le mutant P19?
PCR chevauchante (il faut connaître le principe)
Quels 2 aa sont essentiel à la séquestration des petit ARN dans P19
W42
W39
Quel est le mode d’action de HCPro
Séquestration de Dicer.
Vrai ou faux. HCPro affecte le signal systémique du silencing.
Faux car il n’agit pas directement sur les petits ARN qui peuvent migrer ailleurs.
Vrai ou faux. P19 affecte le signal systémique du silencing.
Vrai car il capte les petits ARN.
Vrai ou faux. Le silencing est impliqué dans le développement.
Vrai
Comment peut-on mettre en évidence des suppresseur d’ARN d’interférence
- A. tumefaciens:
- 1 plasmide avec promoteur 35S et GFP
- 1 plasmide avec promoteur 35S et protéine d’intérêt - Transfection de plante:
- certaine plante juste avec GFP
- Certaine plante avec GFP et protéine d’intérêt - regarder les plante au UV:
Plante juste GFP: un peu de GFP
Plante GFP+Prot. : Bcp de GFP - Northern blot
Plante juste GFP: bcp d’ARN d’interférence
Plante GFP+Prot. : pas bcp d’ARN d’interférence
* Northern Blot important car il permet de montrer que la protéine n’est pas un activateur de transcription*
