Análisis de ácidos nucleicos Flashcards
¿qué es?
Primer paso para los estudios de biología molecular y para las técnicas de DNA recombinante, secuenciación, mutagénesis
Elección de método de extracción depende de:
(3)
- Tipo de ácido nucleico que se va a extraer
- Origen del ácido
- Fuente del ácido
Tipos de ácidos que se pueden extraer
- ssDNA (ADN cadena sencilla)
- dsDNA (ADN de doble cadena)
- RNA
- mRNA
- rRNA
Extracción DNA por la técnica fenol- cloroformo
Características
- Se obtiene ADN de buena calidad y cantidad
- Reactivos tóxicos
- Pérdida significativa de DNA
técnica fenol- cloroformo
Paso 1: Lisis de la célula y liberación de DNA
- Lisis de eritrocitos: cloruro de amonio
- Lisis de membranas celulares y nucleares: SDS (dodecilsulfato sódico)
técnica fenol- cloroformo
Paso 2: Purificación: extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos
- Fenol: cloroformo:alcohol isoamilico 25:24:1
- Fase orgánica: Fenol: lípidos, proteínas y debris celulares
- Fase acuosa: ácidos nucleicos
técnica fenol- cloroformo
paso 3: Precipitación de DNA
- Solución salina saturada (facilitar la agregación del ADN y mejorar su precipitación)
- Etanol 100% (precipitante para provocar la separación del ADN de la solución acuosa)
técnica fenol- cloroformo
paso 4: lavado
Etanol 70%
Agua
→ paso 5: disolución
Espectrofotometría
- Cualquier solución con moléculas suspendidas permite el paso de un haz de luz a través de ella
- Mientras más luz absorba mayor concentración
- DNA y RNA absorción: 260nm
- Proteínas: 280nm
- Fenol: 270
Fluorometría
- Para medir la fluorescencia emitida por una muestra cuando es excitada con luz de una determinada longitud de onda.
- Unión específica de colorantes fluorescentes al ácido nucleico
- Absorbe la luz a una determinada longitud de onda y emite una longitud de onda superior.
Fluorometría
La concentración es proporcional a la intensidad de
emisión fluorescente.
(V/F)
V
Espectrofotometría
la solución de moléculas permite el paso de un haz de luz a través de ella en proporción directa a la cantidad de moléculas que contiene.
(V/F)
FALSO
es en proporción inversa
Hoechst 33258
colorante para la tinción y visualización de ADN
