à partir de la p.73 Flashcards
c’est quoi une chromatographie d’affinité?
La chromatographie d’affinité est une technique de chromatographie qui permet de séparer un composé en utilisant des interactions biologiques entre un ligand spécifique (greffé sur une matrice macromoléculaire) et son substrat, en l’occurrence la molécule à isoler.
Les étapes de la chromatographie d’affinité
- ajout du substrat (équilibre)
- absorption(liaison entre ligand et substrat)
- laver les impurités, enlever la matrice non nécessaire
- faire sortir du tube les substrats( les faire libérées une fois séparées de la matrice)
S’il y a bcp d’affinité, parler de la liaison entre les analytes et les ligands
les analytes peuvent se lier sans problèmes sur les ligands situés sur les molécules dans le tubes
Est-ce que les molécules qui sont pas retenues passent par le détecteur aussi?
oui
quelles sont les molécules purifiées?
sont celles qui sont isolées et liées aux ligands.
comment l’étape d’élution a lieu?
Des ligands libres, pas sur les molécules du liquide (agarose ou silice) dans le tube, sont injectées dans le tube afin que les analytes puissent se lier plus à eux afin d’être éjecter dehors
Est-ce que les ligands sur les molécules d’agarose du liquide dans le tube ont la meme affinité que ceux qui sont libres?
oui
Est-ce que les analytes sont fixés de manière permanents sur les ligands?
non
Les deux types de ligands
- ligand de groupes spécifiques
2. ligands monospecifique
quels sont les ligands monospecifiques?
les anticorps
les enzymes inhibitrices
les hormones
Vrai ou faux
ceux avec une grande affinité dans la phase stationnaire ne restent pas longtemps dans le tube
Faux
il restent plus longtemps du à leur affinité
étapes pour la purification
- choisir la colonne d’affinité dans le tube
- injecter l’échantillon pour favoriser la liaison entre le ligand et la molécule d’intérêt.
- élution de manière non spécifique ou spécifique
- Rééquilibre de la colonne avec le tampon de liaison…
quelle intéraction est réversible pour la purification?
celle où il faut injecter l’échantillon contenant la biomolécule désirante
trois techniques d’élution non-spécifique
- changer la force ionique
- la polarité de l’éluant(substance du tube qui a les ligands sur lui)
- changer le pH
- changer le tampon
deux techniques d’élution spécifique
- avec un soluté compétitif
2. avec un ligand compétitif
avantage de changer le tampon
exemple: les deux techniques non-spécifiques
cela permet l’élution de la biomolécule sans affecter le ligand ( separation entre le ligand et la biomolécule sans qu’ils subissent un changement)
lors de ph extremes oou concentrations élevées de chaotropes, qu’est-ce qui se passe?
le matériel d’affinité ( la biomolécule ou/et le ligand sont affectés- trop petits ou trop grands pour qu’ils soient liées)
Avantage des méthodes spécifiques
cela permet d’augmenter la spécificité du ligand
quels groupes doivent être ajoutés pour ces méthodes spécifiques
des groupements fonctionnels adéquats( avidin, PO4)
Chromatographie par échange d’ions
Séparation c’est un principe de…
d’échange d’ions
une compétition des ions entre la phase mobile et le soluté ionique injecté
Le soluté ionique injecté est pour qui
c’est pour les sites chargées de la phase stationnaire
Phase stationnaire
Résine échangeuse d’anions: quelle charge?
chargée positivement
Phase stationnaire
Résine échangeuse de cations :quelle charge?
chargée négativement
les composants de la phase mobile
- tampon aqueux
2. gradient de ph ou de sel( force ionique)
Les échantillons sont composés de?
- des composés ioniques ou ionisables
les constituants de ces composés?
les acides faibles bases faibles, acides aminés et grosses molécules
Types de détection
- Conductimétrique directe (chromatographie échangeuse d’ion)
- Conductimétrique avec suppression (Chromatographie ionique)
- Absoprtion UV
L’absorption UV quand peut être utilisée?
Lorsque l’analyte a un chromophore
Si la résine cationique est utilisée quel type d’échangeuse il y aura?
échnageuse d’Anions et pour résine anionique: échangeuse de cations
Expliquer la chromatographie par échange d’ions
Les composés avec des charges négatives sont abosrbées dans la phase stationnaire et sont séparés par les composés de charge positive et ceux de charge neutre. Les composés absorbées sont après élués en augmentant la force ionique de la phase mobile
Expliquer la chromatographie par échange d’ions: échangeuse d’anions
Les analytes avec une charge nette plus faibles sont éluées à une concentration moyenne de sel, tandis que les analytes avec une charge nette plus grande nécessite une phase mobile avec une force ionique plus forte encore avant d’être éluées eux aussi.
la désorption (opposé d’absorbance) des analytes chargés négatives vient d’où?
vient d’un anion échangeur qui est réalisé grâce à la concentration élevée de sel.
Si le pH est augmenté, l’analyte va…
ses molécules vont perdre des ions H+
Si du sel (NaCl +) est ajouté, l’analyte va..
le sel va obliger l,échantillon de se deéplacer en diminuant l’intéraction entre la résine anionique des molécules de l’éluant
Quelles protéines ont tendance à être éluées le plus vite: avec une plus grande ou plus faible charge nette au pH donné?
avec une faible charge nette au pH.
Élution progressive des protéines est due grace à quoi?
grâce à l’augmentation du gradient de force ionique
quelle méthode est utilisée avec un échantillon inconnu d”obtenir le profile de la protéine?
L’élution de gradient
l’effet de l’étape’’ Step élution’’ cause?
cause une accélération pour séparer le temps et réduire la consumption buffer en retenant en meme temps le niveau de pureté.
