à partir de la p.73

Question 1

c’est quoi une chromatographie d’affinité?

Answer 1

La chromatographie d’affinité est une technique de chromatographie qui permet de séparer un composé en utilisant des interactions biologiques entre un ligand spécifique (greffé sur une matrice macromoléculaire) et son substrat, en l’occurrence la molécule à isoler.

Question 2

Les étapes de la chromatographie d’affinité

Answer 2

1. ajout du substrat (équilibre)
2. absorption(liaison entre ligand et substrat)
3. laver les impurités, enlever la matrice non nécessaire
4. faire sortir du tube les substrats( les faire libérées une fois séparées de la matrice)

Question 3

S’il y a bcp d’affinité, parler de la liaison entre les analytes et les ligands

Answer 3

les analytes peuvent se lier sans problèmes sur les ligands situés sur les molécules dans le tubes

Question 4

Est-ce que les molécules qui sont pas retenues passent par le détecteur aussi?

Answer 4

oui

Question 5

quelles sont les molécules purifiées?

Answer 5

sont celles qui sont isolées et liées aux ligands.

Question 6

comment l’étape d’élution a lieu?

Answer 6

Des ligands libres, pas sur les molécules du liquide (agarose ou silice) dans le tube, sont injectées dans le tube afin que les analytes puissent se lier plus à eux afin d’être éjecter dehors

Question 7

Est-ce que les ligands sur les molécules d’agarose du liquide dans le tube ont la meme affinité que ceux qui sont libres?

Answer 7

oui

Question 8

Est-ce que les analytes sont fixés de manière permanents sur les ligands?

Answer 8

non

Question 9

Les deux types de ligands

Answer 9

1. ligand de groupes spécifiques

2. ligands monospecifique

Question 10

quels sont les ligands monospecifiques?

Answer 10

les anticorps
les enzymes inhibitrices
les hormones

Question 11

Vrai ou faux

ceux avec une grande affinité dans la phase stationnaire ne restent pas longtemps dans le tube

Answer 11

Faux

il restent plus longtemps du à leur affinité

Question 12

étapes pour la purification

Answer 12

1. choisir la colonne d’affinité dans le tube
2. injecter l’échantillon pour favoriser la liaison entre le ligand et la molécule d’intérêt.
3. élution de manière non spécifique ou spécifique
4. Rééquilibre de la colonne avec le tampon de liaison…

Question 13

quelle intéraction est réversible pour la purification?

Answer 13

celle où il faut injecter l’échantillon contenant la biomolécule désirante

Question 14

trois techniques d’élution non-spécifique

Answer 14

1. changer la force ionique
2. la polarité de l’éluant(substance du tube qui a les ligands sur lui)
3. changer le pH
4. changer le tampon

Question 15

deux techniques d’élution spécifique

Answer 15

1. avec un soluté compétitif

2. avec un ligand compétitif

Question 16

avantage de changer le tampon

exemple: les deux techniques non-spécifiques

Answer 16

cela permet l’élution de la biomolécule sans affecter le ligand ( separation entre le ligand et la biomolécule sans qu’ils subissent un changement)

Question 17

lors de ph extremes oou concentrations élevées de chaotropes, qu’est-ce qui se passe?

Answer 17

le matériel d’affinité ( la biomolécule ou/et le ligand sont affectés- trop petits ou trop grands pour qu’ils soient liées)

Question 18

Avantage des méthodes spécifiques

Answer 18

cela permet d’augmenter la spécificité du ligand

Question 19

quels groupes doivent être ajoutés pour ces méthodes spécifiques

Answer 19

des groupements fonctionnels adéquats( avidin, PO4)

Question 20

Chromatographie par échange d’ions

Séparation c’est un principe de…

Answer 20

d’échange d’ions

une compétition des ions entre la phase mobile et le soluté ionique injecté

Question 21

Le soluté ionique injecté est pour qui

Answer 21

c’est pour les sites chargées de la phase stationnaire

Question 22

Phase stationnaire

Résine échangeuse d’anions: quelle charge?

Answer 22

chargée positivement

Question 23

Phase stationnaire

Résine échangeuse de cations :quelle charge?

Answer 23

chargée négativement

Question 24

les composants de la phase mobile

Answer 24

1. tampon aqueux

2. gradient de ph ou de sel( force ionique)

Question 25

Les échantillons sont composés de?

Answer 25

1. des composés ioniques ou ionisables

Question 26

les constituants de ces composés?

Answer 26

les acides faibles bases faibles, acides aminés et grosses molécules

Question 27

Types de détection

Answer 27

1. Conductimétrique directe (chromatographie échangeuse d’ion)
2. Conductimétrique avec suppression (Chromatographie ionique)
3. Absoprtion UV

Question 28

L’absorption UV quand peut être utilisée?

Answer 28

Lorsque l’analyte a un chromophore

Question 29

Si la résine cationique est utilisée quel type d’échangeuse il y aura?

Answer 29

échnageuse d’Anions et pour résine anionique: échangeuse de cations

Question 30

Expliquer la chromatographie par échange d’ions

Answer 30

Les composés avec des charges négatives sont abosrbées dans la phase stationnaire et sont séparés par les composés de charge positive et ceux de charge neutre. Les composés absorbées sont après élués en augmentant la force ionique de la phase mobile

Question 31

Expliquer la chromatographie par échange d’ions: échangeuse d’anions

Answer 31

Les analytes avec une charge nette plus faibles sont éluées à une concentration moyenne de sel, tandis que les analytes avec une charge nette plus grande nécessite une phase mobile avec une force ionique plus forte encore avant d’être éluées eux aussi.

Question 32

la désorption (opposé d’absorbance) des analytes chargés négatives vient d’où?

Answer 32

vient d’un anion échangeur qui est réalisé grâce à la concentration élevée de sel.

Question 33

Si le pH est augmenté, l’analyte va…

Answer 33

ses molécules vont perdre des ions H+

Question 34

Si du sel (NaCl +) est ajouté, l’analyte va..

Answer 34

le sel va obliger l,échantillon de se deéplacer en diminuant l’intéraction entre la résine anionique des molécules de l’éluant

Question 35

Quelles protéines ont tendance à être éluées le plus vite: avec une plus grande ou plus faible charge nette au pH donné?

Answer 35

avec une faible charge nette au pH.

Question 36

Élution progressive des protéines est due grace à quoi?

Answer 36

grâce à l’augmentation du gradient de force ionique

Question 37

quelle méthode est utilisée avec un échantillon inconnu d”obtenir le profile de la protéine?

Answer 37

L’élution de gradient

Question 38

l’effet de l’étape’’ Step élution’’ cause?

Answer 38

cause une accélération pour séparer le temps et réduire la consumption buffer en retenant en meme temps le niveau de pureté.