Å analysere genekspresjon Flashcards
Hva er funksjonell genomikk?
Studie av hele genomet og dets ekspresjon
Hva betyr å måle genekspresjon?
Å estimere nivået av genprodukt spm er syntetisert
Hva er liciferin?
Et enzym som avgir lys når det er utstyrt med et substrat kjent som luciferin.
lux gener koder for luciferase i bakterier.
luc gener koder for luciferase i eukaryoter.
Hva er GFP?
Green fluorescence protein (GFP) er et stabilt og ugiftig protein fra maneter som kan visualiseres ved dens arvede grønne fluorescence.
Avgir lys ved 510 nm.
Hva kan GFP brukes til?
Overvåke ekspresjon av gener (sammensmelting av regulatoriske regioner og promotorer til gfp genet).
Lokalisere proteiner inne i cellen (genfusjoner er konstruert slik at det gir et hybridprotein. Disse er ofte designet slik at GFP-proteinet er festet enten til den C-terminale enden, eller til den N-terminale enden).
Mange gener har produkter som er kompliserte å analysere ved direkte målinger, eller at produktene til og med en ukjente. Hvordan unngås dette?
Det originale genproduktet blir erstattet ved å smelte dets regulatoriske region til den strukturelle regionen av et reportergen. For å lage denne sammensmeltingen, blir målgenet kuttet mellom sin regulatoriske region og sin kodende region. Det samme gjøres med reporter-genet. Deretter blir den regulatoriske regionen av genet som undersøkes satt sammen med den kodende regionen til reporter-genet?
Denne hybrid-strukturen er en genfusjon.
Hva er elektroforetisk mobility shift / bandshift / gel retardation, og hvordan fungerer det?
Det er en metode for å teste bindingen av et protein til DNA ved å måle endringen til DNAet under gel elektroforese.
Først, DNAet som bærer genet og dets oppstrøms regioner blir markert med difoxygenin eller radioaktivitet, og deretter blir det kuttet med et passende restriksjonsenzym for å få en rekke av fragmenter. Etter kutting blir DNAet separert i to tuber. Til den eksperimentelle prøven blir det mistenkte DNA-bindende proteinet tilsatt. Den andre prøven - kontrollprøven - blir ikke tilsatt noen ting. Begge prøvene kjøres sammen på en ikke-denaturerende agarose gel. Hvis proteinet binder seg til et av DNA-fragmentene, vil komplekset bli større og bevege seg saktere enn det originale DNAet.
Hva er chromatin immunoprecipitation (ChIP)?
En teknikk som identifiserer DNA-bindingssetet for en bestemt transkripsjonsfaktor ved å kryssbinde DNAet til transkripsjonsfaktoren og deretter immunutfelle transkripsjonsfaktoren.
For å utføre ChIP blir celler først behandlet med en protein-kryssbindende reagent som fryser alle proteinene i sin originale lokasjon ved å danne kovalente bindinger mellom ulike aminosyre-sidekjeder. Disse reagentene smelter også proteinene til DNA, slik at proteinene forblir bundet til sine bindingsseter. Deretter blir lange tråder av DNA brutt ned til mindre biter.
Deretter må proteinet av interesse blir isolert, og den prosessen avhenger av antibodies.
Deretter forekommer analyse.
Hva er primer extension?
En metode som tillater presis lokasjon av startpunktet for transkripsjon til det eksakte nukleotidet. Denne tilnærmingen involverer binding av en oligonukleotidprimer til mRNA. Primeren blir deretter forlenget ved revers tanskriptase for å syntetisere DNA som er komplementær til mRNA.
Hva er SAGE?
SAGE (serial analysis of gene expression) er en metode for å overvåke nivåene til flere mRNA-molekyler ved å sekvensere en DNA-konkatemer som inneholder mange serie-bundede tagger utledet fra mRNAene.
