9-Clonage moléculaire Flashcards
Quel est l’intéret du clonage moléculaire ?
1-Produire un ADN recombinant, qui sera produit et transcrit par l’organisme hôte
2- Obtenir une quantité de gène; Le clonage réplique cet ADN . Il sera traduit et exprimé , ce qu’on appel un clonage d’expression
Qu’est ce que le MCS ?
Combien peut on par enzyme en trouver par plasmide ?
Combien par fragment d’ADN ?
C’est une zone multiple de clonage.
C’est la séquence avec le site d’insertion, où on insert le fragment.
1 pour chaques en zyme par plasmide
plusieurs par ADN
De quoi dépend la l’efficacité à rendre une cellule compétente ?
Si elle est petite et super enroulé et grande quantité
Comment peut on répérer les bactéries avec recombinant
1-On met bactérie sur milieu selectif avec anthibiotique .
Si elle croit c’est qu’elle a le plasmide
2-on sépare ceux qui ont le plasmide recombinant et ceux avec le plasmide sans insert avec la méthode bleu blanc
Un plasmide circulaire est digéré , il va migrer plus un moins vite ?
Pourquoi ?
Plus vite car il sera lineaire
Lors de la digestion du plasmide, que reconnait l’enzyme de restriction ?
Qu’induit la digestion
MCS, site de restriction
Des bouts cohésifs francs qui seront compatible avec ceux du fragment digéré avec ces même enzymes
Dans la méthode bleu blanc, comment cela fonctionne ?
Que sont les autre méthode pour detecter un plasmide recombinant ?
Le MCS est dans le gène codant pour le bleu.
Donc s’il y a un insert il ne pourra pas coder pour bleu et ça fera du blanc. on le repique et on le fait se multiplier
PCR: La taille de l’amplicon sera différent si on a un insert ou non . Si c’est recombinant, on aura un amplicon plus grand
Digestion: On digère avec une enzyme de restriction qui est la même que celle de la ligature. on analyse le produit sur le gel
on a deux fragment de longueur connu: plasmide + gel
Pour la PCR, quel est l’avantage de mettre l’une des amorce sur l’insert ?
On vérifie si on a le fragment voulu dans le plasmide et que c’est dans la bonne direction .
Dans le cas d’une digestion, si on a + que deux fragment, que cela signifie-t-il ?
c’est que on a plusieurs site de restriction correspondant à l’enzyme sur l’INSErt
Lorsqu’on utilise une seule enzyme de restriction, quelle est la conséquence
on aura des bouts cohésifs similaires. L’insertion du fragment est possible dans deux sens , on a une insertion non directionnelle mais ce ne sont pas des équivalents
Lorsqu’on utilise 2 enzymes de restriction, quelle en est la conséquence
Bouts cohésif différents.= insertion directionelle
Cependant la re circularisation est impossible car la séquence MCS est perdue, elle sera absente sur le recombinant , la longueur du plasmide est reduite
SI on veut transcrire un brin sur un ADN particulier, combien d’enzyme vaut il mieux utiliser
2 enzymes
où sera positionner les site de restriction sur le fragment à insérer ?
Les amorce seront liés à quoi ?
De chaques cotés ( flanquante 5’ et 3’ ) de séquence d’intérret
en 5’ de l’Amorce on ajoute site de restriction + un spacer qui l’aidera à s’arrimer
Suite à la pcr de l’ADN matrice avec les amorces, comment sera le gène ? qu’aura t.il au bout
Ensuite suite à la digestion ?
On aura un amplicon avec des bout francs composé des nucléotides du site de restriction
Suite à la digestion des bouts cohésifs sont générés, pareil pour le plasmide donc ils pourront s’assembler ensemble
Si les sites de restriction sont présents dans la séquence du fragment à insérer que se passe-til ?
Clivage pendant la digestion
