4. Microscopie Flashcards
Quelles sont les 2 principes qui font en sorte que nous voyons?
La transmission : la lumière passe à travers les objets qui sont translucides.
ex. si le soleil est de l’autre côté d’un verre qui me parait rouge, c’est que ce verre absorbe toutes les autres couleurs et laisse passer le rouge.
La transmission nous indique quelles sont les couleurs absorbées, mais ne nous informe pas sur le relief de l’objet.
- renseigne sur l’absorption des couleurs
La réflexion : la lumière réfléchit sur les objets.
ex. un objet qui me parait vert aura absorbé toutes les couleurs, mais réfléchit le vert.
L’intensité de la lumière qu’on observe dépend de l’angle d’incidence sur la surface, et donc nous renseigne sur le relief de l’objet
- renseigne sur l’absorption des couleurs + le relief de l’objet
Comment fonctionnent les microscopes par transmission? Par réflexion? Où se trouve l’observateur?
Transmission : une source de lumière (ou d’électrons) est dirigée sur l’échantillon, l’observateur se place de l’autre côté de l’échantillon, donc on regarde la lumière qui traverse
Réflexion : une source de lumière (ou d’électrons) est dirigée sur l’échantillon, elle rebondit sur celui-ci, et c’est cette lumière réfléchie qui est captée.
Quels sont les liens entre la longueur d’onde, l’amplitude, la fréquence et l’intensité?
Amplitude : hauteur ceux-bosse
Longueur d’onde : distance entre 2 bosses / 2 creux
L’amplitude et la longueur d’onde sont indépendantes.
La fréquence est liée à la longueur d’ondes : fréquence = vitesse / longueur d’onde
L’amplitude est liée à l’intensité : plus l’amplitude est grande, plus l’intensité est forte
Qu’indique la fréquence
Basse fréquence : moins de bosses en x temps
Haute fréquence : plus de bosses en x temps
Elle nous indique la couleur de la lumière
Basse fréquence : lumière rouge (0,4 microns)
Haute fréquence : lumière bleue (0,7 microns)
Plus la fréquence est haute, plus l’énergie associée à la lumière est grande
Quelle est la limite du microscope optique et pourquoi?
La limite du microscope optique est de l’ordre de 1 micron (diamètre d’une bactérie environ) puisque c’est également la longueur d’onde de la lumière visible.
C’est pourquoi en microscopie électronique on peut observer des choses beaucoup plus fines : les électrons ont une longueur d’onde beaucoup plus petite que celle de la lumière visible (environ jusqu’à 10 nm)
Quel est l’effet des phases sur l’intensité des ondes?
Deux ondes qui sont en phase (bosses et creux en même temps) s’additionnent et donc ont une plus grande intensité
Deux ondes qui sont hors phase (bosses et creux en opposition) s’annulent et donc ont une plus faible intensité (ou intensité nulle)
Qu’est-ce que la réfraction? Comment est-elle applicable aux loupes?
La vitesse d’une onde change selon le milieu dans lequel elle se propage (selon l’indice de réfraction du milieu).
Les différentes couleurs ont des indices de réfraction différents.
Plus l’indice de réfraction est grand, plus l’onde est ralentie, donc plus elle sera déviée en entant dans le milieu (pour passer moins de temps dans le milieu).
Loupe :
La lumière rebondit sur l’objet, passe dans la loupe et va à notre oeil. La loupe a un indice de réfraction différent de celui de l’air, et comme la loupe est bombée et non plane, l’image arrive à notre oeil avec un certain angle. Pour déterminer la grandeur de l’objet, notre oeil interprétera “quel est l’angle des rayons lumineux qui sont arrivés?” : cette image virtuelle sera interprétée comme beaucoup plus grande que l’objet réel.
Qu’est-ce que l’ouverture numérique (ON ou NA)?
C’est l’angle de sortie des rayons lumineux ; l’angle qui détermine la taille de l’image virtuelle. L’ouverture numérique détermine donc le grossissement de l’objectif. Plus l’ouverture numérique est grande, plus l’image est agrandie (et donc l’objectif est plus puissant).
Quel est le lien entre l’ouverture numérique et la distance focale d’un objectif?
Un objectif plus puissant a une plus grande ouverture numérique, et donc une distance focale plus courte (l’objectif doit être plus près de l’échantillon).
À quoi sert l’oculaire dans un microscope optique?
À remettre les rayons lumineux sortant de l’objectif droits pour que l’on puisse les observer
Qu’est ce que la diffraction?
C’est le comportement des ondes quand elles rencontrent un obstacle ou une ouverture. Si la taille de l’objet (ou ouverture) est environ la même que la longueur d’onde, les rayons lumineux sortiront dans tous les sens (arrivent verticaux, sortent en demi-lune).
Pourquoi la diffraction est-elle une limite en microscopie?
C’est une limite de la résolution du microscope : il doit y avoir une séparation minimale pour voir deux points comme étant distincts.
En théorie, cette distance minimale = longueur d’onde / 2. Donc, en microscopie optique, on ne pourrait théoriquement pas distinguer des objets plus proches que 0,2microns (200nm) : moitié de la longueur d’onde du bleu (0,4microns).
En réalité, elle dépend de la longueur d’onde, mais aussi de l’ouverture numérique de notre objectif (n sin(têta)). En réalité, on voit environ autour de 1 micron.
Que nous indiquent les objectifs en microscopie optique? Quelles sont les valeurs maximales?
Le grossissement et l’ouverture numérique sont indiqués.
L’ouverture numérique nous informe sur la résolution de l’objectif : à quel point on peut distinguer les objets les uns des autres.
La valeur maximale de l’ouverture numérique est de
- 1 pour des objectifs secs
- 1,4 pour des objectifs à huile
De quelle façon augmenter la résolution d’une image?
- Augmenter têta : augmenter la taille de l’objectif (augmenter l’angle de sortie de la lumière) et le rapprocher (diminuer la longueur focale)
- Augmenter n : en utilisant de l’huile d’immersion (crée une différence d’indice de réfraction)
- Diminuer lambda : en utilisant une plus petite longueur d’onde (lumière plus près du bleu) donc la distance minimale pour distinguer deux objets devient plus petite
Pourquoi un échantillon épais est-il problématique (microscopie optique) et comment y remédier?
La lumière doit passer à travers l’échantillon.
- Si c’est un liquide, l’étaler
- Faire des coupes avec un microtome : peut nécessiter la fixation, la déshydratation et l’enrobage (pour rendre les tissus assez rigides)
- Faire des croupes avec les cryostats (tissus congelés) qui ont l’avantage d’être près des produits vivants puisqu’on n’y ajoute pas de produits pour stabiliser
Pourquoi le contraste peut-il être un problème?
Les cellules sont composées à 70% d’eau et sont maintenues dans un milieu aqueux. Il n’y a donc pas vraiment de différences d’indices de réfraction, et le tout semble transparent.
Comment améliorer le contraste?
- Par coloration sélective : permet d’observer les cellules par transmission, certains colorants ont des affinités avec certaines molécules de la cellule MAIS les colorants peuvent être toxiques, peu spécifiques…
- Utiliser les propriétés de la lumière : fond noir, contraste de phase, polarisation, contraste d’interférence différentielle (DIC)
Comment fonctionne le microscope à fond noir? Quel est son désavantage?
On met un écran noir (avec anneau claire) entre la source lumineuse et le condensateur. L’anneau lumineux passe dans le condensateur et est focalisée sur l’échantillon. La partie de la lumière qui est déviée par l’échantillon (car il a un indice de réfraction différent) sera récupérée par l’objectif, mais pas la partie qui n’est pas déviée (donc fond noir).
Désavantage : on ne récupère qu’une seule petite partie de la lumière, donc on doit utiliser une grande quantité de lumière au départ, ce qui peut être photo-toxique pour certains échantillons sensibles à la lumière.
Comment fonctionne le microscope à contraste de phase?
Les cellules ont un indice de réfraction un peu plus élevé que l’eau. Lorsque la lumière passe dans la cellule, elle subit donc un changement de phase. Où l’échantillon est plus épais (ex. dans la cellule vs le fond), l’onde ralentit (car indice de réfraction différent). Le microscope à contraste de phase permet aux ondes du fond de l’image (background) et de l’échantillon d’interférer (peuvent s’annuler si hors phase : changement dans l’intensité lumineuse). On peut détecter les changements de phase et donc trouver où l’échantillon a ralenti la lumière (contraste entre onde dans la cellule, et onde juste à côté).
On peut notamment distinguer les contours de la cellule ainsi que son noyau puisqu’ils contiennent des structures qui ralentissent davantage la lumière.
Comment fonctionne le microscope à polarisation?
La lumière non polarisée va dans toutes les directions (onde dans tous les axes). On peut appliquer un filtre qui laissera passer certains rayons lumineux et en absorber d’autres selon leur direction de polarisation.
Le microscope à polarisation permet d’observer les objets biréfringents : qui changent la polarisation de la lumière (c’est le cas pour certains échantillons).
1er filtre polariseur : près de la source lumineuse
2e filtre polariseur : après l’échantillon
Au final, ce qui sort et parvient à l’objectif présente une différence de phase.
La lumière polarisée permet d’améliorer le contraste et nous informe sur l’alignement des molécules (molécules bien organisées créent un milieu biréfringent).
Comment fonctionne le microscope à Contraste d’Interférence Différentielle (DIC ou Nomarski)
Il utilise à la fois les changement de polarisation et les changements de phase.
- Lumière non polarisée
- Polariseur 45deg
- Prisme de Wollaston : divise le faisceau en deux composants de polarisation orthogonale)
- Échantillon : changement de phase différent selon l’orientation de polarisation du faisceau (les tissus plus épais vont faire changer la phase plus fortement, en fonction de la polarisation de la lumière)
- Prisme de Wollaston : recombine les faisceaux de polarisation orthogonales en faisceau de polarisation unique
- Analyseur 135deg
En résumé, que nous indique chacun des 4 microscopes à contraste?
Champ clair : ce qui absorbe la lumière
Fond noir : ce qui réfracte (dévie) la lumière
Contraste de phase : ce qui retarde la lumière
DIC ou Nomarski : ce qui retarde la lumière selon sa polarisation
Qu’est ce que la fluorescence?
C’est l’émission de la lumière d’une couleur suite à l’excitation d’une molécule par une autre couleur.
La lumière absorbée (énergie d’excitation) a toujours une énergie plus grande (donc longueur d’onde plus basse) que celle émise (énergie plus faible, longueur d’onde plus haute).
Comment fonctionne le microscope à fluorescence?
- Source lumineuse f
- Filtre d’excitation qui sélectionne la lumière qui va exciter l’échantillon
- Miroir dichroïque reflète la lumière d’excitation sur l’échantillon (mais laissera passer la lumière émise par l’échantillon, donc ne reflète que certaines longueurs d’ondes)
- Échantillon absorbe lumière d’excitation et émet une lumière de fluorescence
- Filtre d’émission qui sélectionne la lumière émise par l’échantillon (la longueur d’onde que l’on veut observer)
Comment fonctionne le microscope confocal?
Fonctionne comme le microscope à fluorescence, mais contient 2 trous avec le même plan focal, ce qui permet de faire des “coupes” virtuelles de l’échantillon : les sections optiques (son plus grand avantage). On put ensuite faire des reconstructions 3D, ce qui aide à notre compréhension de l’organisation des structures complexes.
Écran avec trou 1 : permet de focaliser la lumière sur un plan précis
Écran avec trou 2 : permet de récupérer la lumière émise par fluorescence dans seulement le plan sélectionné
Sa résolution est meilleure que celle du microscope à fluorescence.
Qu’est-ce que la GFP? Comment l’utilise-t-on?
Green Fluorescent Protein
Souvent utilisée comme marqueur dans les cellules sans fluorescence naturelle
- Produite naturellement par les méduses
- N’est pas toxique pour les cellules
- Demeure relativement stable dans les cellules
Elle absorbe la lumière bleue et émet de la lumière verte : ses pics d’absorption et d’émission sont suffisamment éloignés pour que l’on distingue la lumière émise de la lumière absorbée.
On peut la fusionner à une protéine qui nous intéresse (comme un tag) :
On insère le gène de GFP après le gène qui correspond à la protéine souhaitée. Quand le gène s’exprime, on obtient directement une protéine marquée par la GFP. Le pattern d’expression du tag nous informe sur a distribution de la protéine.
Dans les cellules vivantes, on peut observer le changement d’expression ou de localisation du tag dans le temps (comment la protéine se déplace dans la cellule…).
Qu’est-ce que la Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)? Qu’indique-t-elle?
Cette technique nous donne de l’information sur la mobilité d’une protéine.
On utilise le photoblanchiment : si on éclaire trop la GFP, elle changera de conformation et ne pourra plus émettre de fluorescence, de façon irréversible.
On photoblanchit une région spécifique où on perd la fluorescence. Au fil du temps, la fluorescence reviendra, ce qui nous indique :
- Combien de temps la cellule prend pour refaire des protéines (pour remplacer, plus long)
- Quelle est la vitesse de diffusion/transport/déplacement des protéines autour de cette région qu’on avait éclairée fortement (plus petite échelle de temps, rapide)
Qu’est-ce que la Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)? Qu’indique-t-elle?
Elle permet de démontrer une interaction entre deux protéines.
Protéine 1 = marqueur de fluorescence 1
Protéine 2 = marqueur de fluorescence 2
Si les protéines interagissent, elles seront assez près l’une de l’autre pour que
1. Protéine A absorbe lumière a et émet la lumière b
2. Protéine B absorbe la lumière b (émise par A) et émet la lumière C
Au final, la lumière émise sera celle de la protéine B
Alors que si les protéines n’interagissent pas :
1. Protéine A absorbe lumière a et émet la lumière b MAIS protéine B n’absorbe pas de lumière donc n’émet pas de fluorescence
- La longueur d’onde émise pas A doit être la longueur d’onde d’absorption de B
Comment fonctionne le microscope électronique à transmission (Transmission Electron Microscopy, TEM)?
C’est un microscope électronique : il utilise les électrons plutôt que les photons. Puisque la longueur d’ondes des électrons est beaucoup plus petite, il est possible d’observer des détails beaucoup plus fins, de l’ordre du 2nm (taille d’une protéine globulaire)
C’est un microscope à transmission.
- Source d’électrons
- Lentille électromagnétique du condenseur
- Échantillon
- Lentilles électromagnétiques de l’objectif et du projecteur
- Détecteur d’électrons (car on ne peut pas les voir avec nos yeux)
Par contre, les électrons doivent se déplacer sous vide (microscope = colonne sous vide), donc les échantillons ne peuvent pas être vivants.
On doit utiliser des colorants qui vont fortement absorber les électrons : des métaux lourds comme le O4O (tétroxyde d’osmium) qui colore les lipides. Ces colorants sont très toxiques! (on peut aussi utiliser la coloration négative qui nous donne les contours de l’objet)
Mais permettent une excellente résolution
Comment fonctionne le microscope électronique à balayage (Scanning Electron Microscopy, SEM)?
C’est un microscope par réflexion. Il détecte les électrons qui rebondissent sur l’échantillon. Les échantillons sont fixés, séchés et couverts d’or, car l’or permet aux électrons de « rebondir ».
Il permet une excellente vue de la surface de l’échantillon et une bonne idée de sa structure 3D.
Quels sont les microscopes électroniques? Sont-ils à transmission ou à réflexion?
- Microscope électronique à transmission (TEM) : transmission
- Microscope électronique à balayage (SEM) : réflexion
Quels sont les microscopes optiques? Sont-ils à transmission ou à réflexion?
- Microscope à champ clair : transmission
- Microscope à fond noir : transmission
- Microscope à contraste de phase : transmission
- Microscope DIC ou Nomarski : transmission
- Microscope à fluorescence : réflexion/émission
- Microscope confocal : réflexion/émission
Quelle est la limite de la microscopie optique (mm, nm…)?
1 micron (la taille d’une bactérie). On ne peut voir de virus ou d’organites.
Quelle est la limite de la microscopie électronique (mm, nm…)?
Résolution près de 2nm. On peut voir des virus, les organites, même des protéines globulaires. Mais on ne peut pas voir de petites molécules ou même les atomes.
