4. Microscopie Flashcards
Quelles sont les 2 principes qui font en sorte que nous voyons?
La transmission : la lumière passe à travers les objets qui sont translucides.
ex. si le soleil est de l’autre côté d’un verre qui me parait rouge, c’est que ce verre absorbe toutes les autres couleurs et laisse passer le rouge.
La transmission nous indique quelles sont les couleurs absorbées, mais ne nous informe pas sur le relief de l’objet.
- renseigne sur l’absorption des couleurs
La réflexion : la lumière réfléchit sur les objets.
ex. un objet qui me parait vert aura absorbé toutes les couleurs, mais réfléchit le vert.
L’intensité de la lumière qu’on observe dépend de l’angle d’incidence sur la surface, et donc nous renseigne sur le relief de l’objet
- renseigne sur l’absorption des couleurs + le relief de l’objet
Comment fonctionnent les microscopes par transmission? Par réflexion? Où se trouve l’observateur?
Transmission : une source de lumière (ou d’électrons) est dirigée sur l’échantillon, l’observateur se place de l’autre côté de l’échantillon, donc on regarde la lumière qui traverse
Réflexion : une source de lumière (ou d’électrons) est dirigée sur l’échantillon, elle rebondit sur celui-ci, et c’est cette lumière réfléchie qui est captée.
Quels sont les liens entre la longueur d’onde, l’amplitude, la fréquence et l’intensité?
Amplitude : hauteur ceux-bosse
Longueur d’onde : distance entre 2 bosses / 2 creux
L’amplitude et la longueur d’onde sont indépendantes.
La fréquence est liée à la longueur d’ondes : fréquence = vitesse / longueur d’onde
L’amplitude est liée à l’intensité : plus l’amplitude est grande, plus l’intensité est forte
Qu’indique la fréquence
Basse fréquence : moins de bosses en x temps
Haute fréquence : plus de bosses en x temps
Elle nous indique la couleur de la lumière
Basse fréquence : lumière rouge (0,4 microns)
Haute fréquence : lumière bleue (0,7 microns)
Plus la fréquence est haute, plus l’énergie associée à la lumière est grande
Quelle est la limite du microscope optique et pourquoi?
La limite du microscope optique est de l’ordre de 1 micron (diamètre d’une bactérie environ) puisque c’est également la longueur d’onde de la lumière visible.
C’est pourquoi en microscopie électronique on peut observer des choses beaucoup plus fines : les électrons ont une longueur d’onde beaucoup plus petite que celle de la lumière visible (environ jusqu’à 10 nm)
Quel est l’effet des phases sur l’intensité des ondes?
Deux ondes qui sont en phase (bosses et creux en même temps) s’additionnent et donc ont une plus grande intensité
Deux ondes qui sont hors phase (bosses et creux en opposition) s’annulent et donc ont une plus faible intensité (ou intensité nulle)
Qu’est-ce que la réfraction? Comment est-elle applicable aux loupes?
La vitesse d’une onde change selon le milieu dans lequel elle se propage (selon l’indice de réfraction du milieu).
Les différentes couleurs ont des indices de réfraction différents.
Plus l’indice de réfraction est grand, plus l’onde est ralentie, donc plus elle sera déviée en entant dans le milieu (pour passer moins de temps dans le milieu).
Loupe :
La lumière rebondit sur l’objet, passe dans la loupe et va à notre oeil. La loupe a un indice de réfraction différent de celui de l’air, et comme la loupe est bombée et non plane, l’image arrive à notre oeil avec un certain angle. Pour déterminer la grandeur de l’objet, notre oeil interprétera “quel est l’angle des rayons lumineux qui sont arrivés?” : cette image virtuelle sera interprétée comme beaucoup plus grande que l’objet réel.
Qu’est-ce que l’ouverture numérique (ON ou NA)?
C’est l’angle de sortie des rayons lumineux ; l’angle qui détermine la taille de l’image virtuelle. L’ouverture numérique détermine donc le grossissement de l’objectif. Plus l’ouverture numérique est grande, plus l’image est agrandie (et donc l’objectif est plus puissant).
Quel est le lien entre l’ouverture numérique et la distance focale d’un objectif?
Un objectif plus puissant a une plus grande ouverture numérique, et donc une distance focale plus courte (l’objectif doit être plus près de l’échantillon).
À quoi sert l’oculaire dans un microscope optique?
À remettre les rayons lumineux sortant de l’objectif droits pour que l’on puisse les observer
Qu’est ce que la diffraction?
C’est le comportement des ondes quand elles rencontrent un obstacle ou une ouverture. Si la taille de l’objet (ou ouverture) est environ la même que la longueur d’onde, les rayons lumineux sortiront dans tous les sens (arrivent verticaux, sortent en demi-lune).
Pourquoi la diffraction est-elle une limite en microscopie?
C’est une limite de la résolution du microscope : il doit y avoir une séparation minimale pour voir deux points comme étant distincts.
En théorie, cette distance minimale = longueur d’onde / 2. Donc, en microscopie optique, on ne pourrait théoriquement pas distinguer des objets plus proches que 0,2microns (200nm) : moitié de la longueur d’onde du bleu (0,4microns).
En réalité, elle dépend de la longueur d’onde, mais aussi de l’ouverture numérique de notre objectif (n sin(têta)). En réalité, on voit environ autour de 1 micron.
Que nous indiquent les objectifs en microscopie optique? Quelles sont les valeurs maximales?
Le grossissement et l’ouverture numérique sont indiqués.
L’ouverture numérique nous informe sur la résolution de l’objectif : à quel point on peut distinguer les objets les uns des autres.
La valeur maximale de l’ouverture numérique est de
- 1 pour des objectifs secs
- 1,4 pour des objectifs à huile
De quelle façon augmenter la résolution d’une image?
- Augmenter têta : augmenter la taille de l’objectif (augmenter l’angle de sortie de la lumière) et le rapprocher (diminuer la longueur focale)
- Augmenter n : en utilisant de l’huile d’immersion (crée une différence d’indice de réfraction)
- Diminuer lambda : en utilisant une plus petite longueur d’onde (lumière plus près du bleu) donc la distance minimale pour distinguer deux objets devient plus petite
Pourquoi un échantillon épais est-il problématique (microscopie optique) et comment y remédier?
La lumière doit passer à travers l’échantillon.
- Si c’est un liquide, l’étaler
- Faire des coupes avec un microtome : peut nécessiter la fixation, la déshydratation et l’enrobage (pour rendre les tissus assez rigides)
- Faire des croupes avec les cryostats (tissus congelés) qui ont l’avantage d’être près des produits vivants puisqu’on n’y ajoute pas de produits pour stabiliser
Pourquoi le contraste peut-il être un problème?
Les cellules sont composées à 70% d’eau et sont maintenues dans un milieu aqueux. Il n’y a donc pas vraiment de différences d’indices de réfraction, et le tout semble transparent.
Comment améliorer le contraste?
- Par coloration sélective : permet d’observer les cellules par transmission, certains colorants ont des affinités avec certaines molécules de la cellule MAIS les colorants peuvent être toxiques, peu spécifiques…
- Utiliser les propriétés de la lumière : fond noir, contraste de phase, polarisation, contraste d’interférence différentielle (DIC)
Comment fonctionne le microscope à fond noir? Quel est son désavantage?
On met un écran noir (avec anneau claire) entre la source lumineuse et le condensateur. L’anneau lumineux passe dans le condensateur et est focalisée sur l’échantillon. La partie de la lumière qui est déviée par l’échantillon (car il a un indice de réfraction différent) sera récupérée par l’objectif, mais pas la partie qui n’est pas déviée (donc fond noir).
Désavantage : on ne récupère qu’une seule petite partie de la lumière, donc on doit utiliser une grande quantité de lumière au départ, ce qui peut être photo-toxique pour certains échantillons sensibles à la lumière.
Comment fonctionne le microscope à contraste de phase?
Les cellules ont un indice de réfraction un peu plus élevé que l’eau. Lorsque la lumière passe dans la cellule, elle subit donc un changement de phase. Où l’échantillon est plus épais (ex. dans la cellule vs le fond), l’onde ralentit (car indice de réfraction différent). Le microscope à contraste de phase permet aux ondes du fond de l’image (background) et de l’échantillon d’interférer (peuvent s’annuler si hors phase : changement dans l’intensité lumineuse). On peut détecter les changements de phase et donc trouver où l’échantillon a ralenti la lumière (contraste entre onde dans la cellule, et onde juste à côté).
On peut notamment distinguer les contours de la cellule ainsi que son noyau puisqu’ils contiennent des structures qui ralentissent davantage la lumière.
Comment fonctionne le microscope à polarisation?
La lumière non polarisée va dans toutes les directions (onde dans tous les axes). On peut appliquer un filtre qui laissera passer certains rayons lumineux et en absorber d’autres selon leur direction de polarisation.
Le microscope à polarisation permet d’observer les objets biréfringents : qui changent la polarisation de la lumière (c’est le cas pour certains échantillons).
1er filtre polariseur : près de la source lumineuse
2e filtre polariseur : après l’échantillon
Au final, ce qui sort et parvient à l’objectif présente une différence de phase.
La lumière polarisée permet d’améliorer le contraste et nous informe sur l’alignement des molécules (molécules bien organisées créent un milieu biréfringent).
Comment fonctionne le microscope à Contraste d’Interférence Différentielle (DIC ou Nomarski)
Il utilise à la fois les changement de polarisation et les changements de phase.
- Lumière non polarisée
- Polariseur 45deg
- Prisme de Wollaston : divise le faisceau en deux composants de polarisation orthogonale)
- Échantillon : changement de phase différent selon l’orientation de polarisation du faisceau (les tissus plus épais vont faire changer la phase plus fortement, en fonction de la polarisation de la lumière)
- Prisme de Wollaston : recombine les faisceaux de polarisation orthogonales en faisceau de polarisation unique
- Analyseur 135deg
En résumé, que nous indique chacun des 4 microscopes à contraste?
Champ clair : ce qui absorbe la lumière
Fond noir : ce qui réfracte (dévie) la lumière
Contraste de phase : ce qui retarde la lumière
DIC ou Nomarski : ce qui retarde la lumière selon sa polarisation
Qu’est ce que la fluorescence?
C’est l’émission de la lumière d’une couleur suite à l’excitation d’une molécule par une autre couleur.
La lumière absorbée (énergie d’excitation) a toujours une énergie plus grande (donc longueur d’onde plus basse) que celle émise (énergie plus faible, longueur d’onde plus haute).
Comment fonctionne le microscope à fluorescence?
- Source lumineuse f
- Filtre d’excitation qui sélectionne la lumière qui va exciter l’échantillon
- Miroir dichroïque reflète la lumière d’excitation sur l’échantillon (mais laissera passer la lumière émise par l’échantillon, donc ne reflète que certaines longueurs d’ondes)
- Échantillon absorbe lumière d’excitation et émet une lumière de fluorescence
- Filtre d’émission qui sélectionne la lumière émise par l’échantillon (la longueur d’onde que l’on veut observer)
