4. Fixieren Flashcards
was ist das Ziel der Fixierung?
Abbauprozesse stoppen
Gewebsstruktur- und molekularen Aufbau erhaltten
durch Fixatioan -> Gewebszerstörende Vorgänge gestoppt und durch Konservierung bleibt Zustand erhalten
Durch was kann eine Stabilisierung erreicht werden?
Fixierlösung
Erhitzen
Gefriertrocknen (beim einfrieren -> Stillstand der Stoffwechselprozesse)
Fixationskriterien für chemische Fixationsmittel:
Was beeinflussen diese Faktoren? und welche Faktoren gibt es?
Qualität der Fixation
Zeit Temperatur Probengröße Volumenverhältnis ph-Wert Osmotische Druck
Fixationskriterien für chemische Fixationsmittel:
Faktor Zeit?
- Zeit zwischen Unterbrechung des Blutflusses und Fixierung -> so kurz wie möglich ( Autolyse bei Geweben mit vielen Enzymen sehr schnell
- Dauer der Fixation: Lange genug, um vollständige Durchtränkung & Fixation zu gewährleisten (Alkohole fixieren schneller als Formalin!)
Übermäßig langes Fixieren -> starker Härtung/Schrumpfung und Verlust oder Maskierung von antigenen Eigenschaften
Formalin wirkt stark fragmentierend auf DNA/RNA.
Fixationskriterien für chemische Fixationsmittel:
Temperatur?
Temperaturerhöhung führt zu beschleunigter Durchdringung & Wirkung des Fixationsmittels, beschleunigt aber auch enzymatische Prozesse (Autolyse!)
- Forschung oft bei 4°C ➔ gute Balance zwischen Schnelligkeit der Fixation und Verlangsamen der Autolyse
- Routine erfolgt Formalinfixierung bei Raumtemperatur (RT)(24h)
- Automaten oft bei erhöhter Temperatur
- Mikrowellen beschleunigen die Vernetzung durch Formalin erheblich
Temperaturen >50°C (=Kochen) stabilisieren Gewebe sofort (GROSS HARDENING) Risiko von Morphologieschäden erhöht sich
Fixationskriterien für chemische Fixationsmittel:
Probengröße?
Eindringen des Fixationsmittels erfolgt umso langsamer, je größer das Gewebestück ist (Diffusion!)
Manche Gewebetypen (Darm, Bindegewebskapseln) müssen eröffnet werden Die Probengröße für Routine soll ca. 3-5 mm Dicke betragen.
Diverse Fixationsmittel haben unterschiedliche Eindringgeschwindigkeiten!
Fixationskriterien für chemische Fixationsmittel:
Volumenverhältnis?
Das Volumen der Fixationslösung sollte 15-20x größer sein als das Gewebevolumen, da sich manche Fixationslösungen verbrauchen
Fixationskriterien für chemische Fixationsmittel:
pH-Wert?
Konformation und Löslichkeit von Proteinen hängen vom pH ab
Fixierlösung sollte denselben pH-Wert wie zu fixierende Strukturen
wichtig bei Nachweis von enzymatischen und antigenen Eigenschaften und in situ Hybridisierungen, um Hemmungen von Enzymaktivitäten zu verhindern
Meist werden Pufferlösungen mit neutralen pH-Wert (pH 7,0-7,6) verwendet.
Saure pH-Werte begünstigen gute Kernerhaltung, zerstören aber Mitochondrien und sind ungünstig für RNA in situ Hybridisierungstechniken (ISH).
Aldehydfixation erfolgt am schnellsten bei neutralem pH.
Fixationskriterien für chemische Fixationsmittel:
Osmotischer Druck?
Plasmaosmolarität beträgt 290-300 mosmol/l, dies entspricht einer 0,9% physiologischen Kochsalzlösung
Fixationslösung sollte möglichst dieser Osmolarität entsprechen, meist sind sie jedoch hyperton und es kommt zur Schrumpfung der Zellen von circa 10-50%.
Immersions- und Perfusionsfixation?
Immersionsfixation wird das Gewebe in die Fixationsflüssigkeit gelegt
Perfusionsfixation wird Fixierungsflüssigkeit in das Blutsystem geleitet und so fixiert (nur im Tierversuch).
Chemische Fixation:
Ziel?
Löslichkeit der organischen Matrix oder das Lösungsmittel zu entfernen
Fixieren von Proteinen-Prinzipien:
Löslichkeit?
hohe Molekulargewicht verhindert die chemische Lösung der Proteinteilchen
Jedes EW Molekül ist außen elektrisch geladen
Aufgrund der ionisierten Gruppen an Aminosäuren werden H2O
Moleküle angelagert -> Durch die Dipolstruktur von H2O sind Eiweißmoleküle von einer Hydratationshülle umgeben -> Teilchen bleiben trotz der hohen Masse durch Abstoßung und ihrem Wassermantel in der Schwebe und bilden eine kolloide/ kolloidale Lösung oder ein hydrophiles Sol.
Fixieren von Proteinen-Prinzipien:
Denaturierung?
Chemische Bindungen werden gelockert oder gelöst, es kommt zu einer chemischen Veränderung des Moleküls, ohne dass Teile abgespalten werden, d.h. die Summenformel des Moleküls (Primärstruktur) bleibt gleich, aber die 3D Struktur (Quartär-Tertiär-Sekundärstruktur) verändert sich -> Hydratations-mantel geht verloren -> es bilden sich nach dem Verlust der räumlichen Ordnung Fasermoleküle durch Zusammenlagerung
Freisetzen neuer chem. Gruppen führt zu neuen chem. Bindungen zwischen den einzelnen Teilchen = VERNETZUNG -> Damit geht der Solzustand in den Gelzustand über, denaturierte Moleküle “erstarren” in einem neuen wirren Raumgefüge
Autolyse wird verhindert, da Enzyme unwirksam werden
Starke Denaturierung führt zu einem Verlust jeder biologischen Aktivität ➔ Enzyme funktionieren nicht mehr!
Viele reaktive Gruppen werden bei der Denaturierung freigelegt, deshalb reagieren denaturierte Eiweiße chemisch besser
Diese neuen Gruppen können die Färbbarkeit verbessern!
Durch was wird Denaturierung erreicht?
Hitze Detergenzien Strahlen schütteln Chemikalien Trocken ph-Veränderung
Fixieren von Proteine durch Koagulation?
Durch wasserentziehende Mittel geht die Hydratationshülle verloren, Eiweiß flockt aus = Koagulation
Diese Flockung ist durch Zugabe genügender Wassermengen reversibel
Proteine verändern sich chemisch nicht. z.B. durch konzentrierte Lösungen von Alkoholen und Aceton.
