2 - Culture primaire et lignées cellulaires Flashcards
Que veut dire CMF ?
Calcium and magnésium free.
Qu’est-ce qu’une culture primaire ?
Culture provenant d’explants (dérivée d’un tissus intact où d’un tissu dont les cellules sont dissociées enzymatiquement).
Résultat des cellules qui ont eu la capacité de migrer de l’explant ou qui ont survécu aux techniques de désagrégation et qui sont capable de survie.
Jusqu’à quel moment une culture primaire est considéré comme une culture primaire et que devient t’elle par la suite ?
Jusqu’à ce qu’elle soit repiquée.
Devient une lignée cellulaire.
À quel moment faire les repiquages :
Quand les cellules atteignent une certaine densité, la confluence (manque d’espace).
Risque à prendre des cellules directement d’un organisme et piste de solution :
Risque important de contamination, qu’on peut tenter de diminuer en utilisant des composés avec des antibiotiques.
Définition de sous-culture/repiquage :
Transfert de cellules d’une culture vers un nouveau milieu pour permettre la prolifération de ces dernières.
Définition de lignée cellulaire et caractéristiques :
Population de cellule dérivée de la culture primaire à partir du premier repiquage.
N’implique pas une homogénéité de la population cellulaire ni une connaissance approfondie de cette dernière.
Ces cellules vont proliférer pour une durée limitée.
Définition de souche cellulaire :
Population cellulaire définis par certaines caractéristiques (ex : marqueurs, expression de certaines caractéristiques spécifiques).
Un type cellulaire, donc les caractéristiques sont mieux connus.
Définition de clone :
Population dérivée d’une seule cellule (constituée de cellules identiques).
Avantages d’une culture primaire :
- Plus représentatives des tissus in vivo.
- Elles ont le même Caryotype que le tissu d’origine.
- Cellules différenciés.
Désavantages d’une culture primaire :
- Plus difficile à obtenir.
- Plus susceptible d’être contaminés.
- Durée de vie plus courte en culture.
- Elles peuvent ne pas avoir exactement le même comportement que le tissu in vivo (conditions différentes).
Les 3 méthodes pour initier une culture de cellules :
1- À partir de la croissance de cellules migratoires provenant d’un fragment de tissu (explant) qui a adhéré à un substrat. Autant en animale qu’en végétale.
2- À partir de cellules provenant de la désagrégation mécanique ou enzymatique d’un tissu. (Séparer les cellules d’un explant).
3- À partir de cellules déjà en suspension dans l’organisme (leucocytes) ou ayant ce pouvoir (cellules cancéreuses).
Quel type de cellule ne peuvent pas être cultiver en suspension :
Les cellules adhérentes.
Méthode qui donne la population la plus représentative de de qu’on retrouve in-vivo :
Cellules provenant de la digestion enzymatique.
Les 3 exigences communes à la culture cellulaire :
Retirer tous les tissus nécrosés et les graisses lors de la dissection.
Couper les tissus finement, afin de faire le moins de dommages possibles.
Retirer les enzymes utilisées pour dégradation immédiatement après leur action (centrifugation).
Nommez 4 enzymes qui peuvent être utilisées pour la culture primaire :
Trypsine, pronase, collagénase, dispase.
Comment fait-on pour arrêter l’activité de la trypsine ?
Il faut mettre du milieu de culture, puisque celui-ci contient du sérum dans lequel se trouve un inhibiteur de protéase. Si le milieu n’a pas de sérum, ont peut rajouter du soya bean trypsin inhibitor.
Pourquoi ajoute-t-on de l’EDTA avec la trypsine ?
L’EDTA chélate les ions de la solution, qui sont nuisibles à l’enzyme.
Les différentes procédures pour la dissociation des cellules lors de repiquages (4) :
Brassage.
Racclage cellulaire.
Trypsine.
Dispase.
Quand utiliser la procédure de brassage pour la dissociation des cellules lors des repiquages :
Cellules qui font la mitose ou/et qui adhèrent facilement
Quand utiliser la procédure de racclage cellulaire pour la dissociation des cellules lors des repiquages :
Lignées cellulaires pour lesquelles les protéases doivent être évitées. (analyse protéines membranaires ou récepteurs).
Quel procédures, pour la dissociation des cellules lors de repiquages, convient à une grande variété de lignées cellulaires :
Trypsine.
Quand utiliser la dispase pour la dissociation des cellules lors des repiquages :
Récolter l’épithélium en feuillets.
Ne dissocie pas les cellules épithéliales.
Critères pour le repiquage :
Densité de la culture.
Détérioration du milieu de culture.
Moment du dernier repiquage.
Pourquoi il est préférable d’utiliser du DBSS avec antibiotique lors de la culture primaire ?
Afin de réduire les contaminations, puisque l’animal ou la plante duquel nous prélevons les explants n’est pas stérile
Lors de la culture primaire, les cellules font face à des conditions différentes (in vitro), expliquez ces différences :
- Les cellules passent d’un environnement 3D in vivo à 2D in vitro, car elles se retrouvent moins entourées.
- Changements chimiques possibles.
- Interactions cellules-cellules et cellules-matrice sont réduites et le milieu nutritionnel et hormonal est modifié.
- Favorise l’étalement, la migration et la prolifération des cellules peu spécialisées, plutôt que l’expression de fonctions différenciées.
Distinction entre changement de milieu et repiquage :
Repiquage = transfert de cellules d’une culture vers un nouveau milieu pour permettre la prolifération de ces dernières. Implique l’élimination du milieu de culture et le détachement des cellules du fond de la boîte (si cellules adhérentes).
Changement de milieu = Simplement retirer le milieu et en mettre un autre. Les cellules restent donc dans le même contentant, contrairement à un repiquage.
Expliquer la sélection qui se produit et qui rend la culture plus homogène :
Les cellules capables de proliférer vont augmenter.
Certaines cellules vont survivre sans proliférer (tendance à disparaitre).
Certaines vont mourir.
Signes favorables à un repiquage :
Densité de la culture : Les cellules normales devraient être repiquées aussitôt qu’elles atteignent la confluence; sinon, elles prendront plus de temps à se reproduire lorsqu’elles se retrouveront dans une nouvelle boîte.
Les cellules transformées devraient aussi être repiquées lorsqu’elles atteignent la confluence, mais elles poursuivront leur prolifération même si elles ne le sont pas. Cependant, elles vont se détériorer après 2 générations, si elles ne sont pas repiquées.
Détérioration du milieu de culture : Une baisse de pH est habituellement accompagnée par une augmentation de la densité cellulaire. Peut aussi être le résultat d’une contamination.
Moment du dernier repiquage
