02.Τεχνικές μοριακής βιολογίας

Question 1

Στόχος της κλωνοποίησης ?

Answer 1

1) Απομόνωση γονιδίου(ένθεμα)
2) παραγωγή σε μεγάλες ποσότητες
3) εισαγωγή νέων ιδιοτήτων

Question 2

Οργανισμοί που αξιοποιούνται για κλωνοποίηση?

Answer 2

Βακτήρια
Ιοί
Ζύμες

Question 3

3 Φορείς κλωνοποίησης?

Answer 3

Πλασμίδια
Φοσμίδια(fosmids)
Τεχνητά χρωμοσώματα βακτηρίων(BAC)

Question 4

Στέλεχος E.Coli K-12 τι είδους βακτήριο?Πόσο μεγάλο γονιδίωμα έχει?

Answer 4

Είναι Gram(-) βακτήριο με γονιδίωμα πάνω από 4.6 εκατομμύρια b.p που κωδικοποιεί περίπου 4000 γονίδια —–)Νούμερο 1 βακτηριακό μοντέλο

Question 4

Τι κάνει το σύμπλοκο mcrA/mcrB/mrr?

Answer 4

Αποικοδομεί ξένο DNA που είναι μεθυλιωμένο

Question 5

4 κοινές ιδιότητες φορέων κλωνοποίησης?

Answer 5

1) Ικανότητα αυτόνομης αντιγραφής
2) Περιέχουν ένα γενετικό δείκτη προς επιλογή (συνήθως επικρατή)
3) Μοναδικές θέσεις αναγνώρισης ενζύμων περιορισμού για να διευκολύνουν την πέψη του DNA
4) Ελάχιστη ποσότητα μη απαραίτητου DNA για την βελτιστοποίηση της κλωνοποίησης

Question 6

5 βασικά στάδια της κλωνοποίησης DNA σε πλασμίδιο

Answer 6

Α)Απομόνωση->PCR
1)Επιλογή DNA που θα κλωνοποιηθεί(ένθεμα)

Β)Κλωνοποίηση

2) Δημιουργία συμβατών άκρων ->Πέψη DNA
3) Σύνδεση DNA με τον φορέα(πλασμίδιο)

Γ)Μετασχηματισμός->Δεκτικά κύτταρα

4) Εισαγωγή σε βακτήρια(μετασχηματισμός)–βιβλιοθήκη->Απομόνωση πλασμιδίου
5) Προσδιορισμός αποικιών με την αλληλουχία που κλωνοποιήθηκε ->Blue/White επιλογή

Question 7

Τι είναι η PCR?

Answer 7

Αφορά μια τεχνική απομόνωσης και ενίσχυσης ενός τμήματος DNA μέσω της παραγωγής πολλών αντιγράφων του.Είναι ουσιαστικά μια in vitro μεταφορά του φυσικού μηχανισμού της αντιγραφής DNA.

Question 8

Ένζυμα περιορισμού: που ανακαλύφθηκαν ,ποια η φυσιολογική λειτουργία τους και πως χρησιμοποιούνται στις μέρες μας?

Answer 8

Ανακαλύφθηκαν στους προκαρυώτες(βακτήρια),η φυσιολογική τους λειτουργία είναι αμυντική καθώς καταστρέφουν το ξένο DNA όπως αυτό των ιών προστατεύοντας έτσι το βακτήριο.Στις μέρες μας χρησιμοποιούνται ώς μοριακά ψαλίδια DNA

Question 9

Τι άκρα μπορεί να αφήσουν τα ένζυμα περιορισμού

Answer 9

1) Με μονόκλωνες προεξοχές σαν άκρα που ονομάζονται κολλώδη

2) Χωρίς προεξοχές που ονομάζονται τυφλά

Question 10

Τ4 DNA λιγάση (3 πράγματα)

Answer 10

1) Καταλύει τον σχηματισμό φωσφοδιεστερικών δεσμών
2) Βασικότερο ένζυμο για ανασυνδυασμένο DNA
3) Απαιτεί ATP και ευνοείται από συμπληρωματικά άκρα

Question 11

Στύπωμα κατά SOUTHERN (βήματα) και σκοπός?

Answer 11

1) Ηλεκτροφόρηση ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΟΥ DNA έπειτα από πέψη
2) Στύπωμα σε μεμβράνη
3) Απομόνωση μεμβράνης
4) Υβριδοποίηση με ραδιενεργό ιχνηθέτη νουκλεικού
5) Έκθεση σε φωτογραφικό φίλμ
6) Εμφάνιση φίλμ

Σκοπός:Σάρωση δείγματος DNA με σκοπό την ανίχνευση τμημάτων DNA

Question 12

Στύπωμα κατά NORTHERN (βήματα) και σκοπός

Answer 12

1) Ηλεκτροφόρηση ΟΛΙΚΟΥ RNA
2) Στύπωμα σε μεμβράνη
3) Απομόνωση μεμβράνης
4) Υβριδοποίηση με ραδιενεργό ιχνηθέτη νουκλεικού
5) Έκθεση σε φωτογραφικό φίλμ
6) Εμφάνιση φίλμ

Σκοπός:Σάρωση δείγματος RNA με σκοπό την μελέτη της έκφρασης ενός μεταγράφου

Question 13

Τι είναι μια βιβλιοθήκη? και ποιες οι 3 προυποθέσεις ?

Answer 13

Είναι μια συλλογή κλώνων που περιέχουν τμήματα του συνολικού DNA ή mRNA ενός οργανισμού.

1) Χρωμοσωμικό DNA ή cDNA
2) Καθαρότητα
3) Επιλογή κατάλληλου φορέα

Question 14

Σάρωση βιβλιοθηκών με ιχνηθέτη (2 κυρια βήματα)

Answer 14

1) Στύπωμα κλώνων

2) Εντοπισμός ανασυνδυασμένου κλώνου