שיטות מחקר בביוכימיה Flashcards

Question

מהי שיטת His Tag? מה החסרונות וההיתרונות שלה?

Answer 1

היס טאג זה שיפור של הכרמוטוגרפית זיקה- בשיטות של הנדסה גנטית מנכיסים לפלסמיד המקודד לחלבון רצף של חמישה היסטדינים לאחר מכן מגדלים תרבית ואז לאחר הכנת הליזאט מעבירים את התמיסה דרך קולונת **ניקל ש**איתם יוצרים ההיסטדינים קשרים **קואורדינטיבים** והם ישארו קשורות לקולונה. על **מנת להעיף את החתיכה עם ההיסטידינים** – אפשר להשתמש **_באנטרוקינאז_** ספציפי לרצפי היסטדינים החותך את התוספת שהוספנו בהנדסה גנטית. **יתרון:** זה נוח, וגם זה מאוד מבדיל את החלבון הרצוי משאר החלבונים כלומר קל לדוג אותו חיסרון: זה דורש הנדסה גנטית, צריך להכניס את הטאג לפסלמיד טרם סינטזת החלבון .

Answer 2

**High-performance liquid chromatography** זוהי לא שיטה עצמאית אלא רק שיפור של הכרומטוגרפיה הישנה והטובה. **מיעל את כל שיטות הכרומטגורפיה ע"י הוספה של משאבה היוצרת לחץ ש_מאיצה את התהליך_ _ומעלה את איכות הכרומטוגרפיה_** מאחר והיא מאיצה את התהליך, היא מנטרלת את הנטייה של החלבונים לעבור דיפוזיה ובעצם **מגבירה את הרזולוציה של הכרומטוגרפיה**

Answer 3

**היא שיטה להפרדת לבונים המתבססת על העיקרון שלכל חלבון, בהתאם למבנה המרחבי שלו ולרצף החומצות האמיניות, יש ריכוז מלח אידיאלי עבור מסיסות.** **Salting in** **–** מציין את המעבר של החלבון ממצב **לא מסיס** למצב מסיס (מוקף בעיקר במים ולא במלח) **Salting out** **–** מתאר את המעבר של חלבון ממצב מסיס לאגרטים **בלתי מסיסים**. (מוקף בעיקר במלח ולא במים) בשפת העם: החלבונים מצויים בכיוף שלהם בתמיסה מימית. **בהתחלה** כשמוסיפים מלח בריכוז נמוך המסיסות שלהם **עולה**- כי המלח שומר אותם פרודים זה מזה והקבוצות ההידרופוביות עדיין מצויות עמוק בתוך החלבון כי יש הרבה מים בסביבה **כשמעלים את ריכוז המלח** המלח יתחיל להתחרות עם המים על קשרים האלקטרוסטטים, החלבונים ידחקו ולזה לזה ותחילו ליצור אגרגטים, יתחולל שינוי מרחבי קל שישחוף אזורים הידרופובים בחלבון כדי השיירים ההידרופילים שלהם לא ידחו זה את זה חשמלית ולכן **מעבר לנקודה מסויימת; המסיסות יורדת. הנקודה הזאת היא אינדוודואלית לכל חלבון** בריכוזי מלח **נמוכים** החלבון **מסיס** בריכוז מלח **אידאלים** החלבון **הכי מסיס** בריכוז מלח **גבוה מאוד** החלבון לא מסיס

Answer 4

אמוניום סולפט (NH4)so4

Answer 5

כמו שלכל חלבון יש את ריכוז המלח האידאלי שלו בו הוא הכי מסיס יש לו גם את ריכוז המלח בו הוא יוצר אגרגטים **ללא הנתון הסיפרותי הזה אין אפשר לממש את השיטה** **בקיצור בודקים מה הריכוז האידאלי בו החלבון יוצר אגרגטים ואז יותר קל להפריד אותו**

Answer 6

פוקוס איזואלקטרי היא שיטת להפרדת חלבונים על פי **_pI_** הג'ל בשיטה זו מכיל גרדיאנט **_PH_** בצד של האלקטרודה *החיובית* **_הפי אייצ'**_ הוא_**\_נמוך_** בצד של האלקטרודה *השלילית* ה_**\_פי אייצ'**_ הוא**_\_גבוה_**

Answer 7

בג'ל אלקטרופורזה מולקולות **_קלות_** יותר ינדדו מהר יותר הנדידה באלקטרופורזה הקלאסית מבוססת על מסה

Answer 8

ברגע ששמנו SDS **אין שום משמעות למטענים** שהחלבונים באים איתם "מהבית". כי אס די אס טוען שלילית את החלבון כל חומצה אמינית שנייה כלומר אם לחלבון יש 100 חומצות אמינו 50 יהיו קשורות לאס די אס וטעונות שלילית. **אס די אס גם מנטרל השפעות מרחבית** לכן מה אכפת לנו שהחלבו הראשון גלובולרי- הם עוברים דה נטורציה מלאה כי החומר הזה מ**פרק את כל הקשרים הלא קוולנטי**ם ובעצם אין יותר מבנה שלישוני לכן באלקטרופורזה הדבר היחיד שמשנה הוא **מסה-** ולכן החלבון הקל יותר זה ששוקל 30 קיי דיי ירוץ מהר יותר בג'ל

Answer 9

זהו **לא כלי מתאים לבידוד חלבון** מכיוון שאלקטרופורזה הורסת את המבנה שלו באופן בלתי הפיך, אבל **זהו כלי מאוד יעיל לאנליזה** שמשאפשר לדעת כמה חלבונים שונים נמצאים בדגימה. **איך מסיקים מידע על החלבון הנחקר?** השוואת מרחק הריצה של החלבון הנחקר אל מחרק הריצה של חלבון ידוע מאפשרת גילוי מסה מולארית של החלבון הנחקר.

Answer 10

ההבדל הוא בצפיפות 1. **ג'ל אגרוז** **–** הסטנדרטי – מאפשר הרצה של **מולקולות גדולות**- הפרדה של עשרות נוקלאוטידים 2. **ג'ל פוליאקרילאמיד** – המאפשר רזולציה גבוהה יותר- **אפשר לראות הפרדה של נוקלאוטידים בודדים**. בכללי אפשר להעלות את הריכוז של האגרוז ואז יש לו רזולוציה יותר טובה ***פוליאקרילאמיד-** מתאים מאוד **לחלבונים*** ***אגרוז**-מתאים יותר **ל*** ***DNA****.*

Answer 11

LOG מסה מולארית ביחס למרחק נדידה נותן את הגודל של חלבון נעלם

Answer 12

**בפלטת החלבונים:** חלבונים שרצים בג'ל אלקטרופורזה נצבעים ב**קומסי בלו** ככל שהבנד יותר גדול ככה אנחנו יודעים שהצטבר שם יותר חלבון **בפלטת הדנ"א:** דנ:"א לא נצבע בקומסי בלו מכיוון שהחומר הזה נקשר לשיירים ארומטים של **חומצות אמינו.** בדנ"א משתמשים **בצביעה פלורסנטית** ולכן יצירה של באנד גדול לא אומרת כלום על הצטברות דנ"א באותו גודל בפס מכיוון שפלורסנציה נוטה מטבעה להתפזר בקיצור: בחלבונים זה אומר שיש לי יאמבה חלבון ובדנא זה לא

Answer 13

BME- בטא מרקפתואתנול מחזר **קשרים דיסולפידים** **(קיימים בעיקר במבנים שלישוניים ורביעוניים)** **SDS** מחזר רק **קשרים לא קוולנטים**

Answer 14

ניתן להניח כי לחלבון יש 4 תת יחידות: 30 ו 30 שמקושרות בינהן בקשר SS, ועוד שתי תת יחידות קטנות יותר בגודל של 10KD המוחזקות בינהן בקשר SS לכן החלבון הוא **הטרוטטרמר- בנוי מ4 תת יחידות לא זהות (הומוטטרמר בנוי מ4 תת יחידות זהות)**

Answer 15

הטרו טטרמר אילו הן היו זהות זה היה הומוטטרמר

Answer 16

בשיטה זו קודם עושים פוקוס איזואלקטרי, ואז אלקטרופורזה-בסדר הזה (אי אפשר הפוך כי ה**אס די אס** יהרוס את החלבון) זוהי שיטה שמאפשרת אנליזה של מגוון רחב של חלבונים _לפי שני פרמטרים_ – **מסה ו** **pI** **תחילה יופרדו החלבונים בפוקוס איזו-אלקטרי ולאחר מכן יצופו באס די אס ואז** **ויופרדו גם(!) על פי מסה**

Answer 17

* חארטה קטנה של ביולוגים שכדאי לשים אליה: בפיזיקה **קתודה** זה **חיובי** ואנודה זה שלילי* * ביולוגים החליטו שבאלקטרופורזה הצד **השלילי** זה **קתודה**!! והצד החיובי זה אנודה.* * מפגר אבל זה מה יש*

Answer 18

הפעילות הספציפית היא המדד לדרגת הניקיון- כפי שניתן לראות בטבלה בהתחלה הפעילות הספציפית הייתה 10 ובסוף היא 15,000 לכן החלבון נקי פי 1500 ניצולת: התחלנו עם 100,000 יחידות אנזים וסיימנו עם 45,000- כלומר הניצולת שלו היא 45% הוא איבד 55% מהביברים שלו לאורך התהליך

Answer 19

אימונוגלובינים- בנויים משני מקטעים ## Footnote מקטע ה- **Fab2**– מורכב מהשרשרות הקלות ומחצי מהשרשרת הכבדה, הוא בעל **האפיניות הגבוהה לאנטיגן** מקטע ה-**FC** – מורכב רק ממחצית השרשרת הכבדה, אחראי לפעילות הביולוגיות וזיהוי **האנטיגן על ידי מערכת החיסון**

Answer 20

westren blotting היא שיטה **לאימות** זהות חלבון ידוע. - אחרי שבודדנו אנחנו רוצים להיות בטוחים שזה מה שבודדנו. בשיטה זו, תחילה מורצים חלבונים בג'ל פולי-אקריל אמיד, עם או ללא אס די אס, כך הם מופרדים לפי גודלם. לאחר מכן יש להדגיר את הג'ל עם נוגדן הקשור למולקולת צבע ויודע לזהות את החלבון באופן ספציפי. כאשר לא קיים נוגדן הקשור למולקולת צבע שיודע לזהות את החלבון, ניתן להשתמש בשיטת ה-סנדוויץ. נשתמש בנוגדן ספציפי לחלבון ובנוגדן נוסף (נוגדן שניוני) הקשור למולקולת צבע, המתבייט על מקטעי ה- FC של הנוגדן הראשון.

Answer 21

מה זה **נוגדן ראשוני?** הנוגדן הראשוני תפקידו להיקשר באופן ספציפי ויעודי לחלבון שלי **הנוגדן השניוני** מסומן באיזה שהיא **מולקולת צבע** למה לא לקשור לנוגדן הראשוני גם מולקולת צבע ולחסוך את הנוגדן הראשוני? **כסף**! הנוגדן הראשוני הוא מאוד יקר כי הוא סופר ספציפי והתהליך של הצמדת מולקולת הצבע לנוגדן הורס 99% מהנוגדנים לכן משתמשים בנוגדן שניוני גנרי שיודע להיקשר לכל אתר FC של כל הנוגדנים.

Answer 22

אלייזה זה בדיוק כמו westren blot ההבדל זה שזה אקסקלוסיבי לנוגדנים לשאין דף ניטרוצלולוז והרצה בג'ל אלא תמיסה ששופכים לפלטת באריות ספוחות בנוגדן אופן בסיסי הבדיקה מתבצעת על מצע קשיח, בדרך-כלל פלסטיק, אליו נספחים אנטיגנים (בדרך-כלל חלבונים). לאחר מכן נעשה שימוש בשני נוגדנים לפחות: נוגדן ראשון, הספציפי לאנטיגן מסוים ונוגדן שני, הנקשר לנוגדן הראשון ומוצמד לאנזים נוגדן המחובר לאנזים המזרז ריאקציה שאחד מתוצריה הוא בעל צבע, **מיצר אינטרקציה עם אנטיגן חסר צבע**. מס' אנזימים נמצאים בשימוש מסחרי באליזה והם: alkaline phosphatase horseradish peroxidase Beta-galactosidase.

Answer 23

אלייזה סנדוויץ- כשאין מרקר צבע קשור לנוגדן הראשוני שמים תחילה נוגדל ראשוני, קושרים אליו ואז שמים נוגדן שניוני גנרי שמכיל מולקולת צבע ויודע להיקשר לנוגדן הראשוני באתר המתאים אלייזה עקיפה-בדיקה מכמתת חלבונים כגון בדיקת נוגדנים בסרום, בדיקות מסוג זה משמשות בין השאר לאבחון חשיפה לפתוגן כמו איידס בשיטה זו הפאזה הנייחת מכילה אנטיגנים שקושרים **חלבונים** אופיינים לפתוגן. מוסיפים את סרום הדם של אדם החשוד כנגוע ואם יש לו חלבונים פתוגנים נגיד חלבוני מעטפת של נגיף האיידס אז הם יקשרו לפלטה . מוסיפים נוגדן שניוני שנותן תגובת צבע- בין לבין יש שטיפה כמובן

Answer 24

**Isotope-coded affinity tag** שיטה שמאוד דומה ל micro-arrey. שיטה זו משתמש לזיהוי הבדל בביטוי של חלבון בשני סוגי טיפולים נניח- לוקחים תאי אפיתל המעי מחלקים אותם לצלחת עם כימותרפיה ובלי. ה ICAT הוא למעשה סמן גנרי בנוי מחלק שנקשר לחלבון ומחלק "מדווח": 1. קבוצת סולפט שנקשרת לשיירי ציסטאין בחלבון (אפשר לשתול אוליגוציסטאין מראש) 2. ריאגנט אפיניות כמו ביוטין שנקשר לאבידין בין שני הסמנים יהיה אזור לינקר שמכיל איזטופ כבד או איזטופ קל- **החלק המדווח** בשלב הבא שימים את תמיסת החלבונים במצע עם שתי תנאים שונים ואז נוכל לבדוק את מידת הביטוי של החלבון ולהשוואות את קבוצת החלבונים המסומנת באיזטופ קל לעומת הכבד.

Answer 25

לא נכון האינטראקציה בין אבידין לביוטין היא האינטראקציה **הלא קוולנטית** הכי חזקה בטבע

Answer 26

יש 2 אופציות א. ריאגנט סאנגר נקשר לקצה האמיני ומסמן אותו- DNSC או FDNB ב. ריאגנט אדמן PITC שינהם יודעים להיקשר לקצה האמיני ולסמן אותו

Answer 27

א. בשלב הראשון שמים את ריאגנט אדמן שנקרא PITC- הקצה האמיני מסומן ב. בשלב הבא שמים חומצה הידרוכלורית (פי איצ' נמוך) שגורמת להידרוליזה חומצית. ריאגנט אדמן נחתך ונוצר PTH בריאקציה הזאת כל פעם נחתכת חומצה אמינית אחת מהפפטיד והחוצה אמינית קשורה לנגזרת הריאגנט שנוצרה ג. בכל מחזור מזוהה החומצה האמינית שקשורה לריאגנט באמצעות HPLC **זה יכול להתמשך עד מקסימום 40 חומצות אמינו!** TLDR: שמים את ריאגנט אדמן בתמיסה עם החלבון המבודד הוא נצמד לחומצה האמינית הראשונה ואז עובר הידרוליזה חומצית שגורמת להיווצרות נגזרת של הריגאנט שנקרא PTH. לוקחים את הדגימה שמים בHPLC שיודע לפענח איכשהו איזה חומר זה, ככה עושים שוב ושוב עד למקסימום של 40 חומצות אמינו **הבעיה:** שזה מחייב לחתוך את הפפטיד לצ'אנקים של 40 \*HPLC- כרומטוגרפיית נוזל בלחץ גבוה היא שיטה כרומטוגרפית להפרדת תערובות נוזליות, כלומר שיטה המאפשרת זיהוי וכימות תרכובות נוזליות בתערובת, באמצעות הפרדתן בזרימה במהירויות שונות בצינור אנכי (קולונה). HPLC נחשבת לשיטה מדויקת שיכולה לאתר מרכיבים רבים (גם מאות מרכיבים) בבת-אחת, בריכוזים נמוכים מאוד- משתמשים בזה במעבדות מז"פ

Answer 28

**טריפסין-** חותך חומצות **אמינו חיוביות** *חוץ מהיסטידין* **כימטוטריפסין**- **חותך אחרי** חומצות **אמינו ארומטיות** **פספסין**- חותך **לפני** (קצה אמיני) של לאוצין, פניל אלנין,וטריפטופן -*חותך **פט"ל*** **ציאנוגן ברומיד-** איננו פרוטאז אלא ריאגנט כימי שחותך אחרי **מתיונין** **חותך אחרי= C** **חותך לפני=N**

Answer 29

**ספקטרוסקופיית מסה**- שיטה לבדיקה את רצף חומצות האמינו ואת המסה שלהם ע"י פירוק של פפטיד והרצה בוואקום זה מה שחפרו לי עליו את החיים בכימיה אורגנית. מקבלים את ה NMR של הפפטיד כל גבעה מסמנת קבוצה כימית זה נסמך על הפרעה של השדה המגנטי של כל אטום ומיסוך שהוא מקבל מאטומים שכנים (פיקים לפי שכנים וכל החרא הזה) - **זו שיטה נוספת המתבססת על ספקטרוסקופית מסה.** בשיטה זו, המבוססת על מטרקיס מיוחד, מכניסים את הפטיד את למטריקס מה שגורם לו לעבור התגבשות לקריסטאלים. לאחר מכן אנחנו נשבור את הפפטיד בעזרת לייזר – זה יטען אותם חשמלית, כך שכל חלקיקי טעון במטען חשמלי אחד וכמעט כל החלקיקים טעונים. בשלב הבא נירה את החלקיקים, כך שהאנליזה תתבצע על מסת החלקיקים לפי הזמן שלוקח להם להגיע לגלאי. **ספקטרוסקופיית דיכוריזם מעגלי**- **זוהי שיטה לזיהוי מבנים שניוניים בחלבון,** אודות לבליעת אור שונה באור מקוטב בהתאם למישורים ימנים או שמאליים circular dichroism- בשיטה זו ניתן לקבוע: * מבנים שניוניים בחלבון * קיפול ראוי ונכון של חלבון * האם קיימת דינאמיות במעבר בין מצב מקופל ללא מקופל NMR- **זוהי שיטה לקביעת המבנה התלת מידי של חלבון** בשיטה זו מסיתים את הספין של אטומים מימןH1 בחלבון. הקרינה שהפרוטון פולט כאשר השדה המגנטי מפסיק, בעודו חוזר לספין המקורי, תלוי רבות בסביבה בה נמצא אטום המימן והקבוצות הכימיות הצמודות לו על טכניקה זו מבוססים עקרונות ה MRI הרפואי **דפרקציית****X-Ray**- זוהי שיטה בה נבדק המבנה התלת מימדי של חלבון השיטה מצריכה מיומנות גבוהה הן בעיבוד החומר – קריסטליזציה ואידוי, הן בהקרנה הדורשת מכשור מיוחד ומיגון ראוי והן

שיטות מחקר בביוכימיה Flashcards

(54 cards)