Séance H-immunobuvardage Flashcards
c’est quoi la technique de l’immunobuvardage Western
technique semi quantitative qui permet d’identifier une protéine spécifique
c’est quoi les 5 étapes de l’immunobuvardage
1) électrophorèse (migration)
2) transfert des protéines du gel à une membrane
3) blocage
4) adsorption d’anticorps+lavages
5) détection
c’est quoi la direction du transfert
du bord - au bord +
que inclut le sandwich de transfert
papiers buvards/filtre, gel avec protéines, membrane
2 types de membranes et leurs caractéristiques
nitrocellulose- fragile mais bonne rétention des protéines et haute affinité
PVDF- meilleure résistance mécanique, mais plus de bruit de fond
c’est quoi le type de tampon utilisé pour le transfert de type SDS-PAGE
tampon Towbin (tris-glycine-méthanol)
3 types de blocages
1) 5% BSA
2) lait sans graisse dilué dans TBST
3) gélatine de poisson
les 3 phases de lavages sont après:
le blocage, ajout d’Ac prim., ajout d’Ac second.
4 méthodes de détection bandes
1) radioactivité
2) colorimétrique
3) chemiluminescence
4) chemifluorescence
quelles 2 molécules peuvent être une alternative à l’Ac secondaire car elle reconnaissent l’Ac primaire
1)protéine A et G pour les Ig
2)avidine/steptavidine pour la biotine
2 raisons pour lesquelles le Western est seulement SEMI-quantitatif
1) variations lors du dépôt des échantillons
2) absence de linéarité sur les échelles de []
que veulent dire les bandes inattendues
dégradation protéolytique
que veut dire l’absence des bandes
Ac/Ag/tampon incompatible
que veulent dire les bandes à peine visibles
faible [] Ac ou Ag
que veut dire un bruit de fond élevé sur la membrane
[] élevée anticorps OU tampon pas frais
