examen questions Flashcards
Pourquoi le xénope est-il un modèle pour les expérimentations animales en laboratoire ?
-Développement externe : accès à tous les stades de développement
-Facilité d’élevage : mode de vie essentiellement aquatique, ne remontant à la surface de l’eau que pour respirer => un simple aquarium (enrichi)
Définir le terme de gène rapporteur et citer deux exemples de gènes rapporteurs (dont celui
exprimé dans ces embryons de xénope)
Gène qui code une protéine détectable in situ et qui, utilisé comme transgène,
- sert à marquer des cellules dont on veut suivre le devenir,
-à confirmer l’expression d’un autre transgène
-à évaluer la puissance d’un promoteur.
( Les gènes rapporteurs doivent obéir à 3 conditions :
-être étrangers au génome de l’organisme modifié afin que leur produit n’intervienne pas dans le métabolisme
-leur produit doit permettre une visualisation rapide et précise afin de déterminer dans quel tissu agit le gène modifié
-leur produit doit être quantifiable afin de mesurer l’activité du promoteur induisant la modification).
exemple: GUS (uidA), GF
Par quelle technique de transformation ont été obtenus ces embryons exprimant un gène rapporteur sous le contrôle du promoteur du gène codant l’actine cardiaque, connu pour
être exprimé dans les muscles striés(expliquez son principe)
et pourquoi obtient-on ce profil de fluorescence (le décrire) ?
microinjection: Organisme exprimant un gène, ou le produit d’un gène, de manière ectopique (en
dehors du contexte naturel) ; Transfo 1 cellule au stade zygote ; obtention de nombreux embryons
transformés, Diffusion homogène ou localisée ou graduée du transgène dans l’embryon.
On obtient ici du Mosaïcisme cellulaire. Localisation de la fluorescence en mosaïque, dans les muscles
dorsaux
Sur la base de vos connaissances de cours et TP, citez (en donnant quelques explications) une
application de la transgenèse du xénope
-Etude fonctionnelle du développement du xénope
-étude de la régulation transcriptionnelle des gènes (utilisation de gènes rapporteurs ,étude de promoteur etc)
- évaluation des perturbateurs
endocriniens (exemple lignée TH/bZIP-GFP exposée à un perturbateur thyroidien è société
watchfrog)
-modèles pour l’étude de maladies humaines (sclérose en plaque)
Listez toutes les étapes expérimentales principales nécessaires à suivre pour aboutir à une plante transformée qui pourrait être testée au champ (de la séquence du gène d’intérêt mtlD qui
est parfaitement connue jusqu’à la plante finale transformée, à tester au champ).
Vous expliquerez
brièvement le but de chaque étape (sans rentrer dans le détail des plasmides ou techniques). (3,5
points)
1). Introduction du gène d’intérêt (mtlD) dans un plasmide
–>comportant un **gène de sélection pour la bactérie transformée **(un gène de résistance à un antibiotique)
–>et un gène de sélection pour les futures plantes transformées,
(un gène de résistance à un antibiotique ; même si ce n’est pas la meilleure stratégie pour des plantes ensuite cultivées ; sinon gène de résistance à un herbicide)
2) Transformation de bactéries Escherichia coli avec ce plasmide,
–>sélection des colonies ;
–> permet d’amplifier le nombre de plasmides, que l’on purifie ensuite à partir d’une culture de bactéries.
3) on récupère la séquence d’intérêt (gène d’intérêt + gène de sélection) que l’on introduit dans un
plasmide binaire (au niveau de l’ADN-T)
=>4) puis transfo d’Agrobacterium tumefaciens comportant un
plasmide désarmé (ces plasmides comportent eux-mêmes des gènes de sélection).
- sélection, culture des bactéries. 5)Transformation de disques de feuilles de Niebé par co-incubation
bactéries, disques. Dépôt des disques sur un milieu sans antibiotique pendant 2 jours.
6) Puis lavage des disques dans de l’eau stérile et dépôt sur un milieu contenant l’antibiotique de sélection.
7) Culture des disques dans des conditions appropriées jusqu’à obtention de plantules régénérées à
partir de cals sur le bord des feuilles.
- Avec un scalpel, on récupère ces plantules que l’on repique dans un nouveau milieu permettant la
rhizogenèse. Quand les plantules sont suffisamment grandes, on peut prélever un morceau de feuille
de chaque plante, par exemple, pour vérifier la présence du gène d’intérêt (mtlD) par PCR (si présence
d’un gène rapporteur type GUS, on peut faire aussi une coloration, comme en TP).
- Sélection des plantes transformées, pendant la bonne séquence du gène mtlD (sans erreur),
repiquage en terreau pour obtenir in fine des graines.
- Sur les générations suivantes, il faut continuer à sélectionner les plantes (après auto-fécondations)
pour sélectionner les plantes homozygotes pour le gène mtlD. Il faut sélectionner plusieurs plantes
pour rechercher ensuite la plante avec la meilleure expression.
Citez 1 élément manquant sur ce plasmide et nécessaire pour que la transformation du Niébé
puisse avoir lieu via Agrobacterium (expliquez succinctement sa fonction). (0,5 point)
Les gènes de virulence : nécessaire pour le transfert de l’ADN-T et son intégration dans le génome de
la cellule végétale transformée (remarque : ces gènes sont portés par un autre plasmide mais on peut
les avoir aussi présents sur ce plasmide).
