Cours 7 - à la main Flashcards
Qu’est-ce qu’un vecteur viral
Il s’agit d’une construction artificielle qui utilise des séquences génétiques virales pour introduire du matériel génétique, comme un gène d’intérêt, dans une cellule cible. ( uniquement le fragment d’ADN/ARN en tant que tel )
Qu’est-ce qu’un transgène?
un gène d’intérêt qui est transféré artificiellement dans une cellule cible à l’aide d’un vecteur, comme un vecteur viral.
Qu’est-ce qui est nécéssaire pour qu’un transgène soit stable/permanent?
Le transgène fait partie intégrante du génome de la cellule hôte et il
est transféré dans les cellules filles par division cellulaire.
Qu’est-ce que la thérapie génique?
Elle consiste à faire pénétrer des gènes dans les cellules ou les tissus d’un individu pour traiter une maladie
ou une pathologie.
Comment se déroule la thérapie génique in vivo vs ex-vivo?
In-vivo : Le vecteur (ex : retrovirus ) est injecté directement dans le patient
Ex-vivo : Les cellules à traiter sont extraite du patient, le vecteur ( retrovirus ) lui transfère le gène et les cellules sont réinjectées dans le patient.
Explique l’expérience de griffith
Il y a des Souches virulentes (S) et des Souches non-virulentes (R)
Étapes de l’expérience :
Injection de la souche S vivante dans des souris : Les souris sont mortes.
Injection de la souche R vivante dans des souris : Les souris ont survécu.
Injection de la souche S tuée par la chaleur (non vivante) dans des souris : Les souris ont survécu.
Injection d’un mélange de la souche S tuée par la chaleur et de la souche R vivante : Les souris sont mortes. Étonnamment, Griffith a isolé des bactéries S vivantes dans les cadavres des souris.
Quelle est la différence entre la transformation, la transfection et la transduction ?
Transformation:
- Introduction de matériel génétique à l’intérieur d’une bactérie.
(SANS l’aide d’un vecteur viral)
Transfection:
-Introduction de matériel génétique à l’intérieur d’une cellule eucaryote
(SANS l’aide d’un vecteur viral)
Transduction:
- Introduction de matériel génétique à l’intérieur d’une cellule eucaryote ou d’une
bactérie à l’aide d’un virus /vecteur viral
Qu’est-ce qu’un vecteur oncolytique?
Ces vecteurs sont des virus ou vecteurs qui peuvent se répliquer spécifiquement dans les cellules cancéreuses et les éliminer.
Quelles sont les séquences essentielles aux vecteur viraux?
- Transgène
- Promoteur : est une séquence d’ADN située en amont du transgène qui régule son expression
Séquence Ψ (Psi) : séquence d’encapsidation, essentielle pour l’assemblage des particules virales.
Votre directeur de recherche vous demande d’exprimer un transgène de
9kb dans des cellules quiescentes (qui ne se divisent pas)
– Nommez le vecteur viral que vous utiliseriez et expliquez votre choix.
– Décrivez son organisation génomique.
– Expliquez comment les particules virales du vecteur seront produites.
Vecteur lentiviral ( retroviral ) comme le VIH.
-Infecte cellules quiescentes
- Peuvent injecter un transgène de taille jusqu’à 10kb ( fonctionne avec le 9kb demandé )
Organisation génomique :
Séquences LTR (Long Terminal Repeats) :
5’ LTR : Permet l’expression du transgène.
3’ LTR : Modifiée pour rendre le vecteur auto-inactivable après intégration.
Signal d’encapsidation (Ψ) : Nécessaire pour l’encapsulation du transgène dans les particules virales.
Transgène (TG) : Le gène d’intérêt, ici de 9 kb, inséré entre les LTR.
Promoteur spécifique : Par exemple, un promoteur CMV pour une expression élevée et ubiquitaire.
Absence des gènes gag, pol et env : Ces gènes essentiels à la réplication virale sont supprimés pour assurer la sécurité du vecteur.
Production des particules virales du vecteur :
co-infection transitoire des cellules HEK-293T avec 3 plasmides
Plasmide de transfert :
Contient le transgène (9 kb) sous contrôle d’un promoteur et les séquences LTR.
Inclut le signal Ψ pour l’encapsulation.
Plasmide d’encapsidation :
Fournit les gènes gag et pol nécessaires à la formation des particules virales.
Plasmide d’enveloppe :
Code pour une protéine d’enveloppe, souvent VSV-G, qui confère un large tropisme au vecteur.
Quelles sont les caractéristiques des restrovirus? Enveloppe et ARN positif ou négatif
Enveloppés, ARNsb+
QUelle est l’organisation génomique de rétrovirus simples? Nomme en un
MLV ( Murine leukemia virus )
3 gènes :
gag : code pour protéines structurales de la matrice, capside et nucléocapside
pol : Code pour des enzymes tel que protéase, transcriptase inverse et intégrase
env : Code pour glycoprotéines d’enveloppe
Les retrovirus possèdent les gènes principaux gag,pol et env. Quelles protéines supplémentaires possèdent-ils? Nomme un exemple de virus
Protéines de régulation :
Tat : Stimule la transcription des ARNs viraux en interagissant avec l’élément TAR (Transactivation Response Element).
Rev : Facilite l’exportation des ARN viraux non épissés vers le cytoplasme, où ils seront traduits ou encapsidés.
Protéines accessoires :
Nef, Vpr, Vpu, Vif : Ces protéines modulent l’interaction entre le virus et la cellule hôte pour optimiser la réplication virale et échapper à la réponse immunitaire.
Nef : Réduit l’expression des molécules CMH-I à la surface des cellules pour éviter leur reconnaissance par les lymphocytes T.
Vif : Inhibe l’APOBEC3G, une enzyme antivirale cellulaire.
Vpr : Facilite l’importation du complexe pré-intégration dans le noyau.
Vpu : Favorise le relargage des particules virales et neutralise les protéines antivirales comme BST-2 (tetherin).
Vrai/faux Les retrovirus simples accèdent au materiel nucléaire en lysant la membrane nucléaire
Faux, les retrovirus simples doivent attendre la dissolution de la membrane nucléaire pour accéder au matériel génétique de la cellule hôte.
Quelle modification faut-il faire aux virus retroviraux pour qu’ils deviennent des vecteurs?
Doivent être non réplicatifs
Dans plasmide 1 :
Modification du Génome Viral : Élimination des gènes gag, pol et env: Ces trois gènes sont essentiels pour la réplication du rétrovirus.
Conservation des éléments cis : Les éléments cis sont des séquences d’ADN qui sont nécessaires à la réplication et à l’encapsidation du génome viral, mais qui ne codent pas pour des protéines.
Insertion du Transgène
Dans plasmides 2 et 3 (séparés de plasmide 1 )
Production des Particules Virales UNIQUEMENT LORS DE L’ASSEMBLAGE DU VECTEUR ET JAMAIS APRÈS AVOIR INTÉGRÉ LE GÉNOME
Plasmides d’encapsidation : Comme les gènes gag, pol et env ont été retirés du vecteur viral (plasmide 1 ), ils doivent être présents dans d’autres plasmides pour pouvoir synthétiser les protéines virales.
UNIQUEMENT LORS DE L’ASSEMBLAGE DU VECTEUR ET JAMAIS APRÈS AVOIR INTÉGRÉ LE GÉNOME
C’est le rôle des plasmides d’encapsidation. Pour minimiser le risque que les gènes gag, pol et env ne se recombinent et ne forment un virus réplicatif, ils sont souvent exprimés à partir de deux plasmides différents.
Les vecteurs rétroviraux sont-ils utilisés comme vaccins? Pourquoi?
Non, Les vaccins visent à stimuler une réponse immunitaire contre un agent pathogène. L’expression PERMANENTE du transgène induite par les vecteurs rétroviraux ne correspond pas à cet objectif.
Quelle est la taille maximale du trangène d’un vecteur retroviral?
8 kb
Quelles sont les différences entre les vecteurs lentiviraux et retroviraux?
Lentiviraux ont aussi :
1ere génération
Pseudo-typage avec l’Env d’un autre virus : La protéine Env du VIH-1, responsable de la fixation aux cellules cibles, est remplacée par l’Env d’un autre virus.
RRE=Rev Response Element : Le RRE est une séquence d’ARN présente dans le génome du VIH-1 qui est nécessaire à l’exportation des ARNm viraux du noyau vers le cytoplasme. Cette séquence est conservée dans les VLV pour assurer l’expression efficace du transgène.
2ieme génération :
Idem
+ Pas de gènes accessoires
3ieme génération :
Idem
+ Pas de gènes accessoires (Tat)
- Rev sur un autre plasmid
Vrai/faux Les vecteurs lentiviraux inhibent l’activité des LTRs
Vrai
Les vecteurs lentiviraux sont-ils utilisés comme vaccins?
Non
Quelle est la taille maximale du transgène dans un vecteur lentiviral?
10 kb
Quelles types de cellules peuvent être modifiées par un vecteur lentiviral? Quel est leur tropisme?
cellules quiescentes, les cellules hématopoïétiques
Tropisme : large choix de protéines d’enveloppe (pseudotypage)
Comment selectionner les cellules qui ont été transduites? Vecteurs retroviraux/lentiviraux
Co-expression d’un gène de sélection afin de sélectionner
les cellules transduites
Ce gène de sélection confère un avantage aux cellules qui l’expriment, permettant de les distinguer et de les isoler des cellules non transduites.
Ex : Gène de résistance pour un antibiotique ou la GFP (Green fluorescent protein)!!!!
Quel protéine est ciblé par CAR-T qui sont des lymphocytes T CD8+ modifiés
génétiquement afin de cibler et détruire des cellules cancéreuses?
CD19
Synthèse
