Biochemische Labormethoden Flashcards
Wozu dient die PCR?
Amplifikation spezifischer DNA-Abschnitte aus sehr kleinen Mengen Ausgangs-DNA
Was benötigt man bei einer PCR?
- Hitzestabile DNA-Polymerase
- 2 Primer: ssDNA, 15-25 Bp, komplementär zu den Enden
- DNA-Template
- dNTPs
MgCl2 = Puffer
Wie lauten die Amplifikationszyklen der PCR?
Denaturierung 95 °C
Annealing = Hybridisierung 50 - 60 °C
Elongation am 3’OH-Ende, 70 °C
DNA-Sequenzierung nach Sanger - Prinzip
Verlängerung bricht bei Einbau eines 2’-3’-Didesoxynukleotids ab, da durch fehlendes 3’OH kein neues dNTP angehängt werden kann
Was ist ein Southern Blot?
Nachweis von DNA-Fragmenten durch Übertragung der DNA von einem Elektrophorese-Gel auf eine Membran, Detektion über markierte Oligonukleotid-Sonde
Was ist ein Northern-Blot?
Nachweis von RNA-Fragmenten auf Elektrophorese-Gel, Detektion über markierte Oligonukleotid-Sonde
Was ist ein DNA-Mikroarray?
Nachweis spezifischer Nukleotidsequenzen im Hochdurchsatzverfahren
Schritte der Klonierung
- Restriktionsverdau
- Ligation
- DNA-Transfer in Wirtszellen
- Ausplattieren
- Selektion und Vermehrung
- Aufreinigung
Welche Methoden gibt es um Proteine aufzutrennen und zu isolieren?
Affinitätschromatografie: Auftrennung nach spezifischen Bindungsaffinitäten
Gelfiltration/Größenausschluss-Chromatografie: nach moelkülgröße durch Diffusion durch ein Molekularsieb
Ionenaustausch-Chromatografie: nach Nettoladung
Western Blot
- Übertragung von Prtoeinen von Elektrophoresegel auf eine Membran durch eine senkrecht angelegte elektrische Spannung
- Auftrennung nach Größe
- Nachweis der Proteine durch spezifische Antikörper
ELISA
- Antigen wird auf Oberfläche immobilisiert, durch enzymgekoppelten Antikörper detektiert
- Nachweis und Quantifizierung von Antigenen in Gemischen
Wie kann eine Aminosäurezusammensetzung bestimmt werden?
Mittels Ninhydrinreaktion:
- Hydrolyse des Proteins durch Säurezusatz
- Trennung der AS durch Ionenaustauschchromatografie
- Ermittlung der Konzentration
- Ninhydrin reagiert mit primären Aminogruppen zu blua-violettem Farbstoff
- Farbintensität proportional zur AS-Konzentration
